与淀粉酶信号肽一起表达的分散蛋白制造技术

本发明专利技术涉及包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的核酸构建体，该第一多核苷酸编码来自细菌α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与淀粉酶信号肽一起表达的分散蛋白
[0001]序列表的引用
[0002]本申请含有呈计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。


[0003]本专利技术涉及包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的核酸构建体，该第一多核苷酸编码来自细菌α
‑
淀粉酶的信号肽，该第二多核苷酸编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽；包含所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞；以及用于产生具有氨基己糖苷酶活性的多肽的方法。

技术介绍

[0004]工业生物技术的产品开发面临持续挑战，以期大规模提高酶产量从而降低成本。在过去的几十年中，为此目的采取了两种主要方法。第一种方法是基于经典的诱变和筛选。在这里，特定的基因修饰不是预先定义的，并且主要要求是对检测产量增量敏感的筛选测定。高通量筛选使得能够筛选大量突变体以寻找所希望的表型，即更高的酶产量。第二种方法包括许多策略，范围为从使用更强的启动子和多拷贝菌株以确保目的基因的高表达，到使用密码子优化的基因序列来帮助翻译。然而，给定蛋白质的高水平产生可能又触发细胞机制中将目的酶分泌到培养基中的几个瓶颈问题，这突出了对另外的优化策略的需要。
[0005]信号肽(SP)是存在于许多新合成多肽的氨基末端的短氨基酸序列，它们将这些多肽靶向进入或穿过细胞膜，从而帮助成熟和分泌。SP的氨基酸序列影响分泌效率，并从而影响多肽制造过程的产量。生物信息学工具(如SignalP和SignalP5)可以从氨基酸序列预测SP，但大多数工具无法区分各种类型的SP(Armenteros等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]37:420
‑
423,2019)。此外，SP的氨基酸序列中的大量冗余使得难以预测任何给定的SP用于以工业规模生产酶的效率。因此，SP选择是制造重组蛋白质的重要步骤，但信号肽和成熟蛋白质的最佳组合非常依赖于情境，并且不容易预测。
[0006]分散蛋白(dispersin)是糖苷水解酶20(GH20)家族的一个亚组，它催化N
‑
乙酰基
‑
葡糖胺聚合物(聚
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺，PNAG)的β
‑
1,6
‑
糖苷键的水解，这些聚合物见于例如由细菌产生的生物膜中。在许多情况下，生物膜形成不是人们所需要的，并且在许多应用中希望去除生物膜，这些应用包括医学清洁、衣物洗涤、餐具清洗、伤口护理和口腔护理。例如，WO 2004/061117A2(Kane Biotech公司)描述了包含分散蛋白B(DspB)的组合物用于减少和预防由产生聚
‑
N
‑
乙酰葡糖胺的细菌导致的生物膜的用途，WO 1998/50512(宝洁公司(Procter and Gamble))提供了包含一种或多种氨基己糖苷酶的衣物洗涤或清洁产品，并且WO 2017/186943(诺维信公司(Novozymes A/S))披露了适用于洗涤剂和物品的深度清洁(如衣物洗涤和清洁过程)的分散蛋白。

技术实现思路

[0007]本专利技术基于令人惊讶和创造性的发现，即与同天然或其他信号肽一起表达的分散
蛋白相比，同来自细菌α
‑
淀粉酶的信号肽一起表达的相同分散蛋白提供了改善的分散蛋白产量。
[0008]在第一方面，本专利技术涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含：
[0009]a)第一多核苷酸，该第一多核苷酸编码来自细菌α
‑
淀粉酶的信号肽；和b)第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽；
[0010]其中该第一多核苷酸和该第二多核苷酸以翻译融合方式可操作地连接。
[0011]在第二方面，本专利技术涉及表达载体，这些表达载体包含根据第一方面所述的核酸构建体。
[0012]在第三方面，本专利技术涉及宿主细胞，这些宿主细胞包含根据第一方面所述的核酸构建体和/或根据第二方面所述的表达载体。
[0013]在第四方面，本专利技术涉及用于产生具有氨基己糖苷酶活性的多肽的方法。
附图说明
[0014]图1示出了pMRT558的质粒图谱。
[0015]图2示出了pMRT599的质粒图谱。
[0016]图3示出了pMRT559的质粒图谱。
[0017]图4示出了pMRT667的质粒图谱。
[0018]序列综述
[0019]SEQ ID NO:1是AmyL信号肽编码序列。
[0020]SEQ ID NO:2是AmyL信号肽。
[0021]SEQ ID NO:3是Disp43nat编码序列。
[0022]SEQ ID NO:4是Disp43nat。
[0023]SEQ ID NO:5是SPamyLDisp43syn编码序列。
[0024]SEQ ID NO:6是SPamyLDisp43syn。
[0025]SEQ ID NO:7是SPaprHDisp45编码序列。
[0026]SEQ ID NO:8是SPaprHDisp45。
[0027]SEQ ID NO:9是SPamyLDisp45syn编码序列。
[0028]SEQ ID NO:10是SPamyLDisp45syn。
[0029]SEQ ID NO:11是[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA]基序。
[0030]定义
[0031]cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
[0032]进化枝：术语“进化枝”意指基于追溯至共同祖先的同源特征聚集在一起的一组多肽。多肽进化枝可以被看作是系统发生树，并且进化枝是由共同祖先及其所有直系后裔组成的一组多肽。在系统发生树的进化枝(亚进化枝)内形成一组的多肽也可以享有共同的特性，并且与进化枝中的其他多肽更密切相关。
[0033]编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸
序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。
[0034]控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸构建体，该核酸构建体包含：a)第一多核苷酸，该第一多核苷酸编码来自细菌α
‑
淀粉酶的信号肽；和b)第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽；其中该第一多核苷酸和该第二多核苷酸以翻译融合方式可操作地连接。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中该核酸构建体进一步包含异源启动子，并且其中所述启动子、该第一多核苷酸和该第二多核苷酸可操作地连接。3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中该启动子是cryIIIA启动子或基于cryIIIA的启动子；优选地，该异源启动子是包含该cryIIIA启动子的串联启动子或衍生自该cryIIIA启动子的串联启动子。4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该信号肽是天然存在的信号肽、或天然存在的信号肽的功能性片段或功能性变体。5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该信号肽来自由芽孢杆菌属物种表达的α
‑
淀粉酶；优选地，该信号肽衍生自由芽孢杆菌属物种表达的α
‑
淀粉酶，该芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞；更优选地，该信号肽衍生自由地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌表达的α
‑
淀粉酶；最优选地，该信号肽来自由地衣芽孢杆菌表达的α
‑
淀粉酶。6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该信号肽与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；优选地，该信号肽包含SEQ ID NO:2、基本上由其组成、或由其组成。7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该具有氨基己糖苷酶活性的多肽是微生物多肽，优选地细菌多肽。8.根据权利要求7所述的核酸构建体...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：