用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA、疫苗、mRNA制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，包含编码引起猫传染性腹膜炎的猫冠状病毒UCD1和FIPV

【技术实现步骤摘要】
所示。
[0010]本专利技术优选的方案之一，mRNA包含编码S蛋白受体结合域的mRNA的核苷酸序列。
[0011]基于本专利技术公开的一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，本专利技术还公开了一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA的制备方法，包括以下步骤：
[0012]步骤(1)：对质粒上位于转录启动子和转录终点之间的序列进行修饰；
[0013]步骤(2)：提取质粒，选择限制性内切酶BglII对所提取的质粒进行单酶切；
[0014]步骤(3)：纯化酶切后的质粒，并获得纯化后的模板DNA；
[0015]步骤(4)：稀释模板DNA，并对稀释后模板DNA进行浓度和纯度测定；
[0016]步骤(5)：判断质粒DNA的线性化反应是否进行完全；
[0017]步骤(6)：将获得的线性化的质粒作为模板，体外转录合成mRNA；
[0018]步骤(7)：降解模板DNA；
[0019]步骤(8)：纯化mRNA；
[0020]步骤(9)：测定纯化后mRNA的浓度和纯度；
[0021]步骤(10)：mRNA加帽反应；
[0022]步骤(11)：二次纯化mRNA，并进行电泳鉴定。
[0023]本专利技术优选的方案之一，用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA疫苗包括用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA。
[0024]本专利技术优选的方案之一，用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA疫苗还包括5'
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帽结构、3'
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端聚腺苷酸序列、双脯氨酸突变、5'
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UTR和3'
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UTR中的至少一种。
[0025]本专利技术优选的方案之一，用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA疫苗的递送系统为阳离子或聚阳离子化合物。
[0026]本专利技术优选的方案之一，用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA疫苗的递送系统为脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子。
[0027]本专利技术还公开了一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA疫苗的应用将其应用于制备预防或治疗猫冠状病毒感染导致的疾病的药物中，猫冠状病毒感染导致的疾病为猫传染性腹膜炎。
[0028]综上所述，本专利技术的有益效果为：
[0029]1、本专利技术的猫冠状病毒mRNA疫苗可递送至体内使动物产生免疫反应，用于预防猫传染性腹膜炎。本专利技术编码猫冠状病毒抗原的mRNA递送至动物体内后能够产生FCoV的S蛋白，以作为抗原触发有效保护性免疫应答。
[0030]2、本专利技术猫冠状病毒mRNA疫苗的体内试验结果显示，采用通过本专利方法制得的mRNA脂质纳米粒对猫进行免疫接种后14天，猫体内产生了高滴度的猫传腹病毒中和抗体，与阴性组相比具有显著性差异，可产生良好的保护效果。
附图说明
[0031]图1为本专利技术一个实施例的采用pVXA
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1载体构建FIPV的质粒模板序列图；
[0032]图2为本专利技术实施例1中纯化得到的编码全长S蛋白的mRNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0033]图3为本专利技术实施例2中制得的mRNA脂质纳米粒的透射电镜图；
[0034]图4为本专利技术实施例2中制得的mRNA脂质纳米粒的粒径分布图；
[0035]图5为本专利技术实施例3中使用mRNA脂质纳米粒对猫进行接种后抗体效价的检测结果图。
具体实施方式
[0036]本专利技术提供了一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，包含编码引起猫传染性腹膜炎的猫冠状病毒UCD1和FIPV
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UU4系列毒株及其变体的S蛋白或S蛋白的至少一个片段，S蛋白或S蛋白的片段包含受体结合区序列。
[0037]具体的，mRNA包含编码FCoV的S蛋白，S蛋白是I型FCoV入侵猫科动物细胞最主要的病毒表面膜蛋白，因此编码猫冠状病毒抗原的mRNA递送至动物体内后能够产生FCoV的S蛋白，以作为抗原触发有效保护性免疫应答。S蛋白包含S1和S2两部分，在病毒入侵宿主细胞时，S1是受体结合亚基，具有与细胞受体结合的受体结合域，是病毒附着的主要决定因素，S2是介导膜融合亚基，具有诱导病毒与细胞膜融合的融合肽，可将蛋白固定在细胞的包膜上。
[0038]mRNA编码区编码的S蛋白或S蛋白片段的核苷酸序列来源于血清I型FC oV毒株，如UCD1和FIPV
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UU4系列毒株及其变体。
[0039]mRNA的编码区编码S蛋白的全长序列，如序列表的序列1
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2所示，mRNA的编码区编码S蛋白的受体结构域序列，其可来源于UCD1毒株或FIPV
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UU4毒株，具体的，mRNA编码区编码的S蛋白的全长序列，来源于UCD1毒株，如序列1所示；mRNA，编码区编码的S蛋白的全长序列，来源于FIPV
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UU4毒株，如序列2所示。
[0040]进一步的，mRNA编码区编码的S蛋白或S蛋白片段的核苷酸序列还可以来源于其他血清I型FCoV毒株：TN406，AH1905、Ku2、Black、KY292377、KY566209、KY566210、KY566211、RM、UG
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FH8、FCoV C1Je、C3663、UU10、Yayoi。
[0041]一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA的制备方法，包括以下步骤：
[0042]步骤(1)：对质粒上位于转录启动子和转录终点之间的序列进行修饰；
[0043]步骤(2)：提取质粒，并确保未被蛋白污染，选择合适的限制性内切酶BglII对所提取的质粒进行单酶切；
[0044]步骤(3)：采用苯酚或氯仿萃取及乙醇沉淀法纯化酶切后的质粒，获得经纯化后的模板DNA；
[0045]步骤(4)：取2μL模板DNA用TE缓冲液稀释至200μL后采用紫外分光光度法测定模板DNA的浓度和纯度；
[0046]步骤(5)：利用琼脂糖凝胶电泳判断质粒DNA的线性化反应是否进行完全，电泳图上在正确位置的前方不可有多余的条带，否则以该模板体外转录合成的mRNA不能被有效地翻译和表达；
[0047]步骤(6)：将获得的线性化的质粒作为模板，体外转录合成mRNA；
[0048]步骤(7)：降解模板DNA；
[0049]步骤(8)：利用氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化；
[0050]步骤(9)：采用紫外分光光度法测定纯化后mRNA的浓度和纯度；
[0051]步骤(10)：mRNA加帽反应；
[0052]步骤(11)：利用氯化锂沉淀法对mRNA进行二次纯化，并进行电泳鉴定。
[0053]其中，步骤(3)纯化后的线性质粒包括8μLNTP混合物，2μL10
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Reaction Buffer，2μLEnzyme Mix，余量为Nuclease
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free Water，NTP混合物提供的有效成分为ATP、CTP、GTP和UTP，其中ATP、CTP、GTP和UTP终浓度均为10mM。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，其特征在于：包含编码引起猫传染性腹膜炎的猫冠状病毒UCD1和FIPV
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UU4系列毒株及其变体的S蛋白或S蛋白的至少一个片段。2.如权利要求1所述的用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，其特征在于：所述S蛋白或S蛋白的片段包含受体结合区序列。3.如权利要求1或2所述的用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，其特征在于：所述包含编码S蛋白的mRNA的编码区序列如序列表的序列1
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2所示。4.如权利要求1或2所述的用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA，其特征在于：所述mRNA包含编码S蛋白受体结合域的mRNA的核苷酸序列。5.一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：对质粒上位于转录启动子和转录终点之间的序列进行修饰；步骤(2)：提取质粒，选择限制性内切酶BglII对所提取的质粒进行单酶切；步骤(3)：纯化酶切后的质粒，并获得纯化后的模板DNA；步骤(4)：稀释模板DNA，并对稀释后模板DNA进行浓度和纯度测定；步骤(5)：判断质粒DNA的线性化反应是否进行完全；步骤(6)：将获得的线性化的质粒作为模板，体外转录合成mRNA；步骤(7)：降解模板DNA；步骤(8)：纯化mRNA；步骤(9...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌，韩剑锋，屈梦珂，黄诗琪，苏勇，
申请(专利权)人：四川吉星动物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：