靶向AR靶基因PSA双向eRNAs的反义寡核苷酸及其应用制造技术

本发明专利技术筛选了一类与CRPC有关的AR调控的双向增强子RNAs(eRNAs)，并提供了靶向正义和反义eRNAs的反义寡核苷酸(ASOs)。本发明专利技术ASOs，通过碱基互补原则靶向双向eRNAs，能选择并有效减少CRPC细胞中AR下游致癌靶基因的表达水平，抑制前列腺癌细胞的增殖和集落形成，抑制肿瘤的生长。本发明专利技术提供了新一代前列腺癌靶点、治疗药物。治疗药物。治疗药物。

【技术实现步骤摘要】
靶向AR靶基因PSA双向eRNAs的反义寡核苷酸及其应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及一种靶向AR靶基因PSA双向eRNAs的反义寡核苷酸、及其在制备治疗去势抵抗性前列腺癌药物中的应用。

技术介绍

[0002]前列腺癌(PC)是全球男性患者最常见的癌症之一。早期PC患者可通过手术或根治性放疗等方式进行治疗，预后k好2然而晚期PC容易发生侵袭和转移，患者死亡率较高。自从Huggins得到前列腺癌对雄激素的反应性以来，雄激素剥夺疗法(ADT)已然成为治疗复发性或转移性前列腺癌的一线治疗方法。尽管其初期的效果可高达80
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90％，但几乎所有接受ADT治疗的患者最终都会发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。雄激素生物合成抑制剂Abiraterone和雄激素受体(AR)拮抗剂Enzaluamide(Enz)足FDA批准的两种治疗CRPC患者的药物，但仍然在治疗一年后产生药物抵抗，导致治疗效果差。因此亟需开发和探索新的治疗方法和策略，以实现更好的临床效果。
[0003]增强子RNAs(eRNAs)是一类由增强子转录得到的双向非编码RNAs(ncRNAs)，研究表明其在多种癌症的发生以及对药物的耐受中发挥重要作用。在前列腺癌中，正义eRNAs可通过稳定增强子
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启动子成环、激活p
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TEFb复合物以促进RNA聚合酶Ser2磷酸化等方式促进AR靶基因的转录激活；而反义eRNAs也被证明通过在反义增强子上招募DNMT1，增加基因末端区域DNA甲基化，抑制反义ncRNA的转录来介导AR相关基因mRNA的产生。此外，多个eRNAs也被证实参与CRPC对Enz耐药的进程，例如Zhao等人通过对比分析AR
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eRNAs在不同细胞的差异表达，得到LUZP2或MARC1影响耐药性CRPC细胞的存活。
[0004]本专利技术提供了一种靶向双向eRNA以治疗CRPC的一种有效策略。

技术实现思路

[0005]本专利技术筛选提供了一种与CRPC有关的AR靶基因PSA双向eRNAs，并提供一种靶向正义和反义eRNAs的ASOs，为新一代前列腺癌治疗药物的开发提供了一个全新的药物靶点、治疗药物。
[0006]本专利技术提供了如下技术解决方案：
[0007]本专利技术通过对不同CRPC细胞系进行RNA
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seq、ChIP
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seq分析，并比对不同PC类型患者的组织样本，得到PSA双向eRNAs的表达并验证其与CRPC的相关性。
[0008]通过对雄激素依赖性LNCaP细胞和去势抵抗性C4
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2细胞分别进行RNA
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seq和ChIP
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seq分析，并结合对已发表的LNCaP细胞ChIP
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seq数据的meta分析(包括AR共调节因子FOXA1、MED12和P300；PolII；H2AZ；增强子组蛋白H3K4mel、H3K4me2和H3K27ac)，在LNCaP细胞和C4
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2细胞中得到6193个AR相关eRNAs的表达。进一步分析显示1865个AR相关eRNAs在C4
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2细胞中的信号强度明显高于LNCaP细胞，其中包括PSA eRNAs。
[0009]通过分析、对比初期PC和CRPC患者组织样本，得到CRPC患者中PSA正义eRNA表达增加，同时高表达PSA反义eRNA的患者生化复发时间更短，且与PSA mRNA呈显著正相关性，进
一步验证了PSA双向eRNAs在CRPC进程中的相关性。
[0010]因此，第一方面，本专利技术提供一种与CRPC相关的AR靶基因PSA双向eRNAs，其完整核苷酸序列为：E1如SEQ ID NO.1所示的正向序列和E2如SEQ ID NO.2所示的反向序列。
[0011]进一步地，PSA正义和反义eRNAs分别选取三个特异性较高的靶序列，将作为后续ASOs的互补位点2所述E1包括E1
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1、E1
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2、E1
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3三个靶序列；E2包括E2
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1、E2
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2、E2
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3三个靶序列；序列依次如SEQ ID NO.3～8所示。
[0012]第二个方面，本专利技术提供一种靶向上述双向eRNAs的ASOs，所述ASOs具有如SEQ ID No.9～14所示的核苷酸序列。
[0013]第三个方面，本专利技术提供一种PSA基因表达的靶向抑制剂，包括上述的ASOs。
[0014](1)本专利技术通过qRT
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PCR实验，探究敲降C4
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2细胞中PSA双向eRNAs或使用靶向上述eRNAs的ASOs对PSA基因转录调控的重要性。
[0015](2)通过LNAs分别敲除C4
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2细胞PSA正义eRNA、反义eRNA或联合敲降双向eRNAs，测定C4
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2细胞中PSA mRNA的表达水平。qRT
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PCR实验结果表明，敲除PSA正义eRNA和/或反义eRNA均能显著降低C4
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2细胞中PSA mRNA的表达水平，提示PSA eRNAs对PSA基因表达具有调控作用。
[0016](3)进一步地，使用靶向不同PSA eRNAs位点的上述ASOs处理C4
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2细胞，评价其对PSAmRNA的抑制作用；qRT
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PCR实验结果同样得到，上述ASOs均能有效抑制PSA mRNA的表达水平，表明其具有作为一种PSA基因表达靶向抑制剂的潜力。
[0017]第四个方面，本专利技术提供上述ASOs或PSA基因表达靶向抑制剂在制备治疗CRPC药物中的应用。
[0018](1)本专利技术通过MTS、集落形成和小鼠异种移植肿瘤等实验，分别在体内外水平上探究上述ASOs或PSA基因表达靶向抑制剂对前列腺癌的抑制作用，以验证其在治疗CRPC病程中的应用潜力。
[0019](2)通过MTT和集落形成实验，测定ASOs对C4
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2细胞增殖活性的影响。实验结果表明靶向PSA eRNAs的ASOs能有效抑制CRPC细胞的细胞增殖和集落形成。
[0020](3)为进一步探究ASOs对小鼠前列腺癌生长的抑制作用，检测异种移植肿瘤小鼠给予不同ASOs后肿瘤体积随时间的变化。实验结果表明使用ASOs处理后，小鼠的肿瘤出现明显的缩小，即本专利技术中所述ASOs能有效抑制前列腺癌的生长。
附图说明
[0021]图1为PSA双向eRNAs在CRPC中的表达图。其中，(A)为LNCaP和C4
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2细胞AR结合位点周围AR ChIP
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seq和RNA
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seq平均信号分布的聚合图；(B)LNCaP(实线)和C4
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2(虚线)细胞之间AR eRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双向eRNAs，其特征在于含有SEQ ID No.3～8。2.权利要求1所述的双向eRNAs，其特征在于：其一含有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5；另一含有SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8。3.权利要求2双向eRNAs，其特征在于所述双向eRNAs核苷酸：其一序列为SEQ ID NO.1；另一序列为SEQ ID NO.2。4.一种靶向权利要求1～3所述双向eRNAs的反义寡核苷酸，其特征在于：所述反义寡核苷酸具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑜，李祎亮，黄轶驰，侯文彬，魏会强，陈乐园，侯越，宁洪鑫，尚海花，于江，毕常芬，勾文峰，郭江红，许飞飞，
申请(专利权)人：中国医学科学院放射医学研究所，
类型：发明
国别省市：