一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型及构建方法和应用技术

本申请公开了一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型及构建方法和应用。本发明专利技术通过电转技术将非整合型Yamanaka因子质粒导入携带PUS1纯合突变的骨髓单个核细胞，将其重编程为iPSC。同时，针对该突变位点设计定点sgRNA和修复模板，利用CRISPR/Cas9技术构建突变位点修复的iPSC株。针对正常人来源的iPSCs、患者特异性iPSCs及其修复株建立了改进的红系定向分化方法来评估其分化能力。本发明专利技术构建的患者特异性iPSC模型和红系分化方法可以很好地模拟红系分化阻滞的表型，并可快速、便捷和高效地对CSA或其他贫血的潜在药物进行筛选。CSA或其他贫血的潜在药物进行筛选。CSA或其他贫血的潜在药物进行筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型及构建方法和应用


[0001]本申请涉及细胞构建
，特别涉及一种使用MLASA患者骨髓单个核细胞构建模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型及构建方法和应用。

技术介绍

[0002]铁粒幼细胞性贫血(Sideroblastic anemia，SA)属于贫血中的一种，主要表现为红系前体细胞中出现异常的铁颗粒，即铁过载的线粒体环绕分布在细胞核周围形成“环铁”，患者骨髓涂片经普鲁士蓝染色后可见明显的蓝色颗粒。SA可以分为遗传性和获得性两大类，其中遗传性铁粒幼细胞性贫血(Congenital sideroblastic anemia，CSA)是因先天性基因突变造成的，已报道的致病相关基因主要涉及血红素合成、铁硫簇合成及转运和线粒体蛋白合成等通路。
[0003]线粒体肌病、乳酸酸中毒和铁粒幼细胞贫血综合征(MLASA)是一类罕见的常染色体隐性遗传病，属于CSA的综合征型。根据该患者携带的突变基因分成的三种亚型MLASA1
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3，分别由假尿苷合成酶1(Pseudouridine Synthase 1，PUS1)、线粒体酪氨酰
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tRNA合酶(Mitochondrial tyrosyl
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tRNA synthetase，YARS2)和线粒体DNA上的MT
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ATP6基因突变所致。因PUS1突变导致的MLASA1患者具有发病早、病情重、死亡率高的特点。除了MLASA患者通常具有的儿童期进行性运动不耐受、铁粒幼细胞性贫血(通常见于青春期前后)、高乳酸血症和线粒体肌病等疾病症状外，MLASA1患者还会出现认知障碍、发育迟缓、心肌病、吞咽以及呼吸困难等表现，且不同个体临床表现异质性大，即使同一家族携带同一突变的两名患者临床表型也不完全一致。YARS2催化线粒体酪氨酰tRNA的合成，对线粒体蛋白编码起到关键调控作用。MLASA2患者病情较MLASA1患者整体偏轻，某些MLASA2患者的铁粒幼细胞性贫血可以得到完全临床缓解。此外，一项研究发现并非所有YARS2基因突变患者都会出现环铁，只有约76％的患者会出现这一疾病表征。线粒体基因组上的MT
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ATP6基因突变，会影响氧化呼吸链复合物V的功能，目前仅一个病例被确诊为MLASA3。而MT
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ATP6m.8993T>G突变是三十年前最先发现的线粒体基因组致病性突变之一，患者常表现为多系统疾病，但主要病症出现在神经和肌肉相关的组织，未发生血液系统疾病。目前针对MLASA，除输血、祛铁治疗及其他系统性的对症处理外，尚无有效治疗手段。
[0004]PUS1属于PUS家族的一员，该家族成员在依赖或者不依赖RNA的情况下与tRNA、snRNA、rRNA以及mRNA等多种RNA结合并对其进行假尿苷修饰。人PUS家族共有13个成员，根据所含的不同结构域可分成6类。已有研究表明部分成员同疾病存在紧密的关联，其中PUS3纯合突变会导致智力障碍，而PUS7纯合突变不仅影响智力发育，还可以通过影响翻译来调控肿瘤的发生。此外，PUS家族也参与细胞内的生物过程和能量代谢，如PUS10既可以调控miRNA的生物合成也可以影响胞浆的tRNA功能，而RPUSD3和RPUSD4则被确定对氧化磷酸化有重要调控作用。PUS1蛋白有两个亚型，一个定位于细胞核中，可以对特定的pre
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mRNA和胞浆的tRNA进行修饰，另一个亚型定位在线粒体中，修饰特定的线粒体tRNA。因PUS1蛋白序列在物种间高度保守，近年来陆续有科研团队通过酵母和小鼠等模式生物以及患者来源的成
纤维细胞和淋巴母细胞对PUS1基因突变展开了初步的研究。然而，这些工作仅对PUS1基因突变造成的线粒体功能异常和氧化呼吸链的缺陷进行了部分解析，对于MLASA1患者的贫血致病机制研究还未深入展开。而MLASA疾病本身的复杂性及其病例的罕见性也大大限制了对其的研究。自1995年首次发现MLASA1患者以来，至2020年二十五年间可追溯到的携带PUS1基因突变的患者不足20例，且患者间的突变位点及突变类型明显不同，临床表型更是存在明显异质性。所以，为深入研究疾病病理机制，也为筛选治疗相关疾病的药物创造条件，研发一种模拟红系分化阻滞的细胞系模型具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本申请为了解决上述技术问题，提供一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型及构建方法和应用。
[0006]第一方面，本申请提供了一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型的构建方法，是采用以下技术方案得以实现的。
[0007]一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型的构建方法，包括以下步骤：通过电转技术将Yamanaka因子导入单个核细胞中，将其重编程为诱导性多能干细胞(iPSC)，然后利用CRISPR
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Cas9技术建立修复株；经过多能性验证后，使用两种方法向红系定向诱导分化。
[0008]进一步的，一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0009]S1.特异性iPSC及其修复株的构建
[0010]I.患者骨髓单个核细胞的分离；
[0011]II.患者特异性iPSC的构建；
[0012]III.利用CRISPR
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Cas9技术构建修复株；
[0013]IV.iPSC的培养；
[0014]S2.iPSC基因型鉴定和多能性验证
[0015]I.基因型鉴定；
[0016]II.多能性标记物转录水平的检测；
[0017]III.多能性标记物蛋白表达水平的检测；
[0018]IV.畸胎瘤的三胚层分化；
[0019]S3.iPSC红系定向分化
[0020]I.低氧法进行红系诱导；
[0021]II.常氧法进行红系诱导。
[0022]更进一步的，步骤S1 II中，通过电转将载有Yamanaka转录因子的质粒导入携带PUS1纯合突变(c.523delC,p.P175fs)的骨髓单个核细胞中，将电转后的细胞悬液转移到含有feeder细胞的红系培养基II中，在低氧条件下培养7
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14后转入常氧状态进行培养，得到特异性iPSC。
[0023]更进一步的，步骤S1 III中，将特异性iPSC与sgRNA、Cas9混合后进行电转，将电转后的细胞悬液转移到含Y因子的培养基E8中，常氧条件下培养得到修复株；sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0024]更进一步的，步骤S3 I中，使iPSC形成均一克隆，然后使用分化液在低氧条件下诱导为生血内皮细胞，富集CD34
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细胞，最后将生血内皮向造血转化。
[0025]更进一步的，步骤S3 II中，使iPSC形成拟胚体，拟胚体用红系诱导培养基正常氧条件下培养。
[0026]第二方面，本申请提供了一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型，是采用以下技术方案得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：通过电转技术将Yamanaka因子导入单个核细胞中，将其重编程为诱导性多能干细胞，然后利用CRISPR
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Cas9技术建立修复株；经过多能性验证后，使用两种方法向红系定向诱导分化。2.根据权利要求1所述的一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.特异性iPSC及其修复株的构建I.患者骨髓单个核细胞的分离；II.患者特异性iPSC的构建；III.利用CRISPR
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Cas9技术构建修复株；IV.iPSC的培养；S2.iPSC基因型鉴定和多能性验证I.基因型鉴定；II.多能性标记物转录水平的检测；III.多能性标记物蛋白表达水平的检测；IV.畸胎瘤的三胚层分化；S3.iPSC红系定向分化I.低氧法进行红系诱导；II.常氧法进行红系诱导。3.根据权利要求2所述的一种模拟红系分化阻滞的iPS细胞模型的构建方法，其特征在于：步骤S1II中，通过电转将载有Yamanaka转录因子的质粒导入携带PUS1纯合突变的骨髓单个核细胞中，将电转后的细胞悬液转移到含有feeder细胞的红系培养基II...

【专利技术属性】
技术研发人员：初雅婧，汪碧忱，袁卫平，施均，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：