使用分区和甲基化依赖性核酸酶分析DNA的组合物和方法技术

本公开内容提供了涉及分析DNA(诸如无细胞DNA)的组合物和方法。在一些实施方案中，无细胞DNA来自患有或怀疑患有癌症的受试者和/或无细胞DNA包括来自癌细胞的DNA。在一些实施方案中，将DNA分区为第一子样品和第二子样品，其中第一子样品包含比第二子样品具有更大比例的核苷酸修饰(例如胞嘧啶修饰)的DNA，并且使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触。使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触。使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用分区和甲基化依赖性核酸酶分析DNA的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年9月30日提交的美国临时专利申请第63/086,000号和2020年10月23日提交的美国临时专利申请第63/105,183号的优先权的权益，为了所有目的将其中各项通过引用以其整体并入本文。
专利

[0003]本公开内容提供了涉及分析DNA(诸如无细胞DNA)的组合物和方法。在一些实施方案中，无细胞DNA来自患有或怀疑患有癌症的受试者和/或无细胞DNA包括来自癌细胞的DNA。在一些实施方案中，将DNA分区为第一子样品和第二子样品，其中第一子样品包含比第二子样品具有更大比例的核苷酸修饰(例如，胞嘧啶修饰)的DNA，并且使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触。
[0004]引言及概述
[0005]癌症每年导致全球数百万人死亡。因为早期癌症趋向于对治疗更易感，因此癌症的早期发现可以导致改进的结果。
[0006]不适当控制的细胞生长是癌症的标志，通常由以下遗传改变和表观遗传改变的积累导致：诸如拷贝数变异(CNV)、单核苷酸变异(SNV)、基因融合、插入和/或缺失(插入/缺失(indel))、包括胞嘧啶的修饰(例如，5
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甲基胞嘧啶、5
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羟甲基胞嘧啶和其他更氧化的形式)以及DNA与染色质蛋白和转录因子的缔合的表观遗传变异。
[0007]活检是用于检测或诊断癌症的常规方法，其中从癌症的可能部位提取细胞或组织，并分析相关的表型和/或基因型特征。活检具有侵入性的缺点。
[0008]基于体液(诸如血液)分析(“液体活检”)来检测癌症，是基于对从癌细胞释放到体液中的DNA的观察的令人感兴趣的替代方法。液体活检是非侵入性的(有时仅需要抽血)。当前的癌症诊断测定无细胞核酸(例如，无细胞DNA或无细胞RNA)的方法可以集中于检测肿瘤相关的体细胞变异，包括单核苷酸变异(SNV)、拷贝数变异(CNV)、融合和插入缺失(indel)(即，插入/缺失)，它们都是用于液体活检的主流靶。越来越多的证据表明，非序列修饰，如无细胞DNA中的甲基化状态和片段组信号(fragmentomic signal)能够提供关于无细胞DNA来源和疾病水平的信息。无细胞DNA的非序列修饰，当与体细胞突变判定(calling)组合时，能够产生比单独由任何一种方法可得的肿瘤状态评估更全面的肿瘤状态评估。然而，由于无细胞DNA的低浓度和异质性，开发用于分析提供关于核碱基修饰的详细信息的液体活检材料的准确且灵敏的方法一直具有挑战性。
[0009]分离和处理可用于液体活检程序中进一步分析的无细胞DNA的级分(fraction)是这些方法的重要部分。因此，需要用于分析无细胞DNA(例如，在液体活检中)的改进的方法和组合物。
[0010]本公开内容旨在满足对无细胞DNA的改进的分析的需要和/或提供其他益处。因此，提供以下示例性实施方案。
[0011]实施方案1是分析样品中DNA的方法，该方法包括：a)将样品分区为多于一个子样
品，所述多于一个子样品包括第一子样品和第二子样品，其中第一子样品包含比第二子样品具有更大比例的胞嘧啶修饰的DNA；b)使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触，从而降解第二子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第二子样品，并且任选地使第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触，从而降解第一子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第一子样品；以及c)从第一子样品或经处理的第一子样品的至少一部分捕获包含表观遗传靶区的第一靶区组，以及从经处理的第二子样品的至少一部分捕获包含表观遗传靶区的第二靶区组。
[0012]实施方案2是分析样品中DNA的方法，该方法包括：a)从样品捕获包含表观遗传靶区的第一靶区组；b)将该靶区组分区为多于一个子样品，所述多于一个子样品包括第一子样品和第二子样品，其中第一子样品包含比第二子样品具有更大比例的胞嘧啶修饰的DNA；以及c)使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触，从而降解第二子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第二子样品，并且任选地使第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触，从而降解第一子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第一子样品。
[0013]实施方案3是根据实施方案1的方法，该方法还包括对从捕获自或存在于以下中的一个或更多个中的表观遗传靶区进行定量：第一子样品、经处理的第一子样品、或经处理的第二子样品。
[0014]实施方案4是根据实施方案2的方法，其中定量包括定量扩增，任选地其中定量扩增是定量PCR。
[0015]实施方案5是根据前述实施方案中任一项的方法，该方法还包括对第一靶区组和第二靶区组或经处理的第二子样品中的DNA进行测序。
[0016]实施方案6是根据前一实施方案的方法，其中对经处理的第二子样品中的DNA和经处理的第一子样品中的DNA进行测序。
[0017]实施方案7是根据前述实施方案中任一项的方法，其中表观遗传靶区包括低甲基化可变靶区组。
[0018]实施方案8是根据前一实施方案的方法，其中低甲基化可变靶区组包括在至少一种类型的组织中具有比来自健康受试者的无细胞DNA中的甲基化程度低的甲基化程度的区域。
[0019]实施方案9是根据前一实施方案的方法，其中该方法还包括至少部分地基于低甲基化可变靶区组中的区域的序列或量来确定癌症的存在、不存在或可能性。
[0020]实施方案10是根据实施方案7
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9中任一项的方法，该方法还包括至少部分地基于低甲基化可变靶区组中的区域的序列或量来对样品中的肿瘤DNA进行定量。
[0021]实施方案11是分析样品中DNA的方法，该方法包括：a)将样品分区为多于一个子样品，所述多于一个子样品包括第一子样品和第二子样品，其中第一子样品包含比第二子样品具有更大比例的胞嘧啶修饰的DNA；b)使第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触，从而降解第二子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第二子样品，并且任选地使第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触，从而降解第一子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第一子样品；以及c)从第一子样品或经处理的第一子样品的至少一部分捕获包含表观遗传靶区的第一靶区组。
[0022]实施方案12是根据实施方案11的方法，该方法还包括对从第一子样品或经处理的
第一子样品中的一个或更多个捕获的或存在于经处理的第二子样品中的表观遗传靶区进行定量。
[0023]实施方案13是根据实施方案12的方法，其中定量包括定量扩增，任选地其中定量扩增是定量PCR。
[0024]实施方案14是根据实施方案11
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13中任一项的方法，该方法还包括对第一靶区组中的DNA和来自第二子样品的DNA进行测序。
[0025]实施方案15是根据前述实施方案中任一项的方法，其中DNA包括从体液获得的DNA，任选地其中体液是血浆、尿液、淋巴或脊髓液。
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分析样品中DNA的方法，所述方法包括：a)将所述样品分区为多于一个子样品，所述多于一个子样品包括第一子样品和第二子样品，其中所述第一子样品包含比所述第二子样品具有更大比例的胞嘧啶修饰的DNA；b)使所述第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触，从而降解所述第二子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第二子样品，并且任选地使所述第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触，从而降解所述第一子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第一子样品；以及c)从所述第一子样品或所述经处理的第一子样品的至少一部分捕获包含表观遗传靶区的第一靶区组，以及从所述经处理的第二子样品的至少一部分捕获包含表观遗传靶区的第二靶区组。2.一种分析样品中DNA的方法，所述方法包括：a)从所述样品捕获包含表观遗传靶区的第一靶区组；b)将所述靶区组分区为多于一个子样品，所述多于一个子样品包括第一子样品和第二子样品，其中所述第一子样品包含比所述第二子样品具有更大比例的胞嘧啶修饰的DNA；以及c)使所述第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触，从而降解所述第二子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第二子样品，并且任选地使所述第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触，从而降解所述第一子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第一子样品。3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括对捕获自或存在于以下中的一个或更多个中的表观遗传靶区进行定量：所述第一子样品、所述经处理的第一子样品、或所述经处理的第二子样品。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述定量包括定量扩增，任选地其中所述定量扩增是定量PCR。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述第一靶区组和所述第二靶区组或所述经处理的第二子样品中的DNA进行测序。6.根据前一项权利要求所述的方法，其中对所述经处理的第二子样品中的DNA和所述经处理的第一子样品中的DNA进行测序。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表观遗传靶区包括低甲基化可变靶区组。8.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述低甲基化可变靶区组包括在至少一种类型的组织中具有比来自健康受试者的无细胞DNA中的甲基化程度低的甲基化程度的区域。9.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述方法还包括至少部分地基于所述低甲基化可变靶区组中的区域的序列或量来确定癌症的存在、不存在或可能性。10.根据权利要求7
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9中任一项所述的方法，所述方法还包括至少部分地基于所述低甲基化可变靶区组中的区域的序列或量来对所述样品中的肿瘤DNA进行定量。11.一种分析样品中DNA的方法，所述方法包括：a)将所述样品分区为多于一个子样品，所述多于一个子样品包括第一子样品和第二子样品，其中所述第一子样品包含比所述第二子样品具有更大比例的胞嘧啶修饰的DNA；
b)使所述第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触，从而降解所述第二子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第二子样品，并且任选地使所述第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触，从而降解所述第一子样品中非特异性分区的DNA以产生经处理的第一子样品；以及c)从所述第一子样品或所述经处理的第一子样品的至少一部分捕获包含表观遗传靶区的第一靶区组。12.根据权利要求11所述的方法，所述方法还包括对从所述第一子样品或所述经处理的第一子样品中的一个或更多个捕获的或存在于所述经处理的第二子样品中的表观遗传靶区进行定量。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述定量包括定量扩增，任选地其中所述定量扩增是定量PCR。14.根据权利要求11
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13中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述第一靶区组中的DNA和来自所述第二子样品的DNA进行测序。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA包括从体液获得的DNA，任选地其中所述体液是血浆、尿液、淋巴或脊髓液。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA包括从测试受试者获得的无细胞DNA(cfDNA)。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞嘧啶修饰是甲基化。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胞嘧啶修饰是在胞嘧啶5位处的甲基化。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第一子样品与甲基化敏感性核酸内切酶接触。20.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述甲基化敏感性核酸内切酶裂解未甲基化的CpG序列。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述甲基化敏感性核酸内切酶是AatII、AccII、AciI、Aor13HI、Aor15HI、BspT104I、BssHII、BstUI、Cfr10I、ClaI、CpoI、Eco52I、HaeII、HapII、HhaI、Hin6I、HpaII、HpyCH4IV、MluI、NaeI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、SmaI和SnaBI中的一种或更多种。22.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述甲基化敏感性核酸内切酶是BstUI、HpaII、Hin6I、HhaI或AccII中的一种或更多种，任选地其中所述甲基化敏感性核酸内切酶是(i)BstUI和HpaII；(ii)BstUI、HpaII和Hin6I；或(iii)HhaI和AccII。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述甲基化依赖性核酸内切酶裂解甲基化的CpG序列。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述甲基化依赖性核酸内切酶是MspJI、LpnPI、FspEI或McrBC中的一种或更多种。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一靶区组包括高甲基化可变靶区组。26.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述高甲基化可变靶区组包括在至少一种类型的组织中具有比来自健康受试者的无细胞DNA中的甲基化程度高的甲基化程度的区
域。27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述方法还包括至少部分地基于所述高甲基化可变靶区组中的区域的序列或量来确定癌症的存在、不存在或可能性。28.根据权利要求25
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27中任一项所述的方法，所述方法还包括至少部分地基于所述高甲基化可变靶区组中的区域的序列或量来对所述样品中的肿瘤DNA进行定量。29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表观遗传靶区包括甲基化对照靶区组。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一表观遗传靶区组和/或所述第二表观遗传靶区组包括片段化可变靶区组。31.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述片段化可变靶区组包括转录起始位点区。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述片段化可变靶区组包括CTCF结合区。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一靶区组还包括序列可变靶区。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二靶区组还包括序列可变靶区。35.根据权利要求33或34所述的方法，其中对应于所述序列可变靶区组的DNA分子以比对应于所述表观遗传靶区组的DNA分子大的捕获产量被捕获。36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中捕获包括使待捕获的DNA与靶特异性探针组接触，由此形成靶特异性探针和DNA的复合物。37.根据前一项权利要求所述的方法，其中捕获还包括将所述复合物与未与靶特异性探针结合的DNA分离，从而提供捕获的DNA。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述靶特异性探针组被配置为以比对应于所述表观遗传靶区组的DNA大的捕获产量捕获对应于所述序列可变靶区组的DNA。39.根据权利要求33
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38中任一项所述的方法，所述方法包括将对应于所述序列可变靶区组的DNA分子测序到比对应于所述表观遗传靶区组的DNA分子大的测序深度。40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述测序步骤之前扩增所述DNA，或者在所述捕获步骤之前扩增所述DNA。41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在捕获之前将衔接子连接到所述DNA，任选地其中所述连接在扩增之前发生或与扩增同时发生。42.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述衔接子是包含条形码的衔接子。43.根据权利要求41或42所述的方法，其中在使所述第二子样品与甲基化依赖性核酸酶接触之前，将所述衔接子连接到所述DNA。44.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述衔接子耐受所述甲基化依赖性核酸酶的消化。45.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述衔接子是未甲基化的。46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述样品分区为多于一个子样品包括基于甲基化水平进行分区。47.根据前一项权利要求所述的方法，其中所述分区步骤包括使所收集的cfDNA与固定
在固体支持物上的甲基结合试剂接触。48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括对所述第一子样品和所述第二子样品、所述经处理的第一子样品和所述第二子样品、所述第一子样品和所述经处理的第二子样品、或所述经处理的第一子样品和所述经处理的第二子样品差异性加标签。49.根据前一项权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁，
申请(专利权)人：夸登特健康公司，
类型：发明
国别省市：