沉默昆虫体内的WA基因在用于防治昆虫的应用制造技术

本发明专利技术涉及沉默昆虫体内的WA基因在用于防治昆虫的应用。通过RNA干扰例如半翅目昆虫体内的WA基因可以达到沉默所述基因。体内的WA基因可以达到沉默所述基因。体内的WA基因可以达到沉默所述基因。

【技术实现步骤摘要】
NO. 64所示中的至少一种的dsRNA来防治点蜂缘蝽（Riptortus pedestris）。
[0010]本专利技术之二提供了一种核酸，其序列为如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 13、SEQID NO. 16、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQID NO. 33、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44、SEQID NO. 47、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 57、SEQ ID NO. 58、SEQID NO. 61和SEQ ID NO. 64所示中的至少一种。
[0011]本专利技术之三提供了一种dsRNA，其正义链的序列为如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 13、SEQID NO. 16、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 47、SEQID NO. 54、和SEQ ID NO. 61所示中的至少一种。
[0012]需要指出的是，本领域的技术人员公知，对于dsRNA来讲，需要将各序列中的t替换为u，然而为了简便起见，在本专利技术中不再单独列出由t替换为u的完整序列。
[0013]本专利技术的有益效果：本专利技术首次发现沉默昆虫体内的WA基因可使昆虫致死，特别是例如在沉默绿盲蝽中包含该基因第206至447位区域内的200 bp以上片段的第7日可使昆虫的死亡率达到95%以上，并且绿盲蝽中该基因第206至328位区域的片段的第7日可使昆虫的死亡率达到70%以上，这说明包含绿盲蝽中该基因第206至328位区域的dsRNA或其他物种中与之同源的区域内的dsRNA可以作为高效致死的dsRNA片段。总之，通过用于沉默WA基因的RNAi制剂和RNAi转基因植物可以达到防治昆虫，特别是半翅目昆虫的目的。
附图说明
[0014]图1显示了绿盲蝽WA基因9条截短序列的位置关系的示意图。
具体实施方式
[0015]以下通过优选的实施案例的形式对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本专利技术的限制。
[0016]如无特别说明，本专利技术的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
[0017]实施例1绿盲蝽基因的生物信息学分析利用生物信息学技术及软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析，筛选到绿盲蝽（Apolygus lucorum）如SEQ ID NO. 1所示的序列，暂定名为WA基因。
[0018]供试昆虫及组织收集将新鲜玉米（Zea mays）和四季豆（Phaseolus vulgaris L）的混合物作为饲料饲养绿盲蝽幼虫和成虫，饲养温度为27℃，相对湿度为65%，光照为16:8（L:D）。
[0019]提取RNA使用绿盲蝽整只成虫用Trizol试剂（4头成虫：1 mL Trizol）提取总RNA，最后将总RNA 溶于RNase
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free H2O中。取1 μL样品稀释至5 μL，其中2.5 μL进行电泳检测，2.5 μL用NanoDrop仪器检测；剩余的RNA用于cDNA合成或者保存于
−
70 ℃冰箱。
[0020]合成第一链cDNA
整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作步骤合成cDNA以用于后续dsRNA的合成。
[0021]合成dsRNA本专利技术从绿盲蝽的基因中选取AlWAs1至AlWAs9的9条截短的干扰靶标片段进行后续的克隆及dsRNA合成。9条截短序列的位置关系的示意图如图1所示，其中，AlWAs1和AlWAs2两条截短序列的长度均在200 bp以上，且WA基因中所处的位置仅21bp的重叠；AlWAs3则是在AlWAs2的基础上进一步截短；AlWAs4、AlWAs5和AlWAs6三条截短序列的长度均在130 bp左右，且均是AlWAs3进一步的截短序列；AlWAs7、AlWAs8和AlWAs9三条截短序列的长度均在65 bp左右，且均是AlWAs4或AlWAs5进一步的截短序列。
[0022]（1）扩增AlWAs1至AlWAs9片段引物设计：根据绿盲蝽WA基因CDS序列（如SEQ ID NO. 1所示），用PrimerPremier 5.0 软件设计绿盲蝽该基因第10
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227位（AlWAs1）的上游引物AlWA
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F1（SEQ ID No. 2）和下游引物AlWA
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R1（SEQ ID No. 3）用于PCR扩增AlWAs1片段（SEQ ID NO. 4）；绿盲蝽该基因第206
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516位（AlWAs2）的上游引物AlWA
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F2（SEQ ID NO. 5）和下游引物AlWA
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R2（SEQ ID NO. 6）用于PCR扩增AlWAs2片段（SEQ ID NO. 7）；绿盲蝽该基因第206
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447位（AlWAs3）的上游引物AlWA
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F3（SEQ ID NO. 8）和下游引物AlWA
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R3（SEQ ID NO. 9）用于PCR扩增AlWAs3片段（SEQ ID NO. 10）；绿盲蝽该基因第206
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341位（AlWAs4）的上游引物AlWA
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F4（SEQ ID NO. 11）和下游引物AlWA
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R4（SEQ ID NO. 12）用于PCR扩增AlWAs4片段（SEQ ID NO. 13）；绿盲蝽该基因第251
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383位（AlWAs5）的上游引物AlWA
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F5（SEQ ID NO. 14）和下游引物AlWA
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R5（SEQ ID NO. 15）用于PCR扩增AlWAs5片段（SEQ ID NO. 16）；绿盲蝽该基因第317
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447位（AlWAs6）的上游引物AlWA
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F6（SEQ ID NO. 17）和下游引物AlWA
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R6（SEQ ID NO. 18）用于PCR扩增AlWAs6片段（SEQ ID NO. 19）；绿盲蝽该基因第206
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272位（AlWAs7）的上游引物AlWA
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F7（SEQ ID NO. 20）和下游引物AlWA
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R7（SEQ ID NO. 21）用于PCR扩增AlWAs7片段（SEQ ID NO. 22）；绿盲蝽该基因第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.沉默昆虫体内的WA基因在用于防治所述昆虫的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过RNA干扰所述昆虫体内的WA基因来达到沉默所述基因。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述昆虫为半翅目（Hemiptera）昆虫中的至少一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述昆虫为盲蝽科（Miridae）、蝽科（Pentatomidae）、缘蝽科（Coreidae）、粉虱科（Aleyrodidae）和飞虱科（Delphacidae）昆虫中的至少一种。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述昆虫为绿盲蝽（Apolygus lucorum）、茶翅蝽（Halyomorpha picus）、点蜂缘蝽（Riptortus pedestris）、烟粉虱（Bemisia tabaci）、灰飞虱（Laodelphax striatellus）和褐飞虱（Nilaparvata lugens）中的至少一种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过向所述昆虫施用正义链的序列为如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 25和SEQ ID NO. 28所示中的至少一种的dsRNA来防治绿盲蝽（Apolygus lucorum）；通过向所述昆虫施用正义链的序列为如SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 33和SEQ ID NO. 36所示中的至少一种的dsRNA来防治烟粉虱（Bemisia tabaci）；通过向所述昆虫施用正义链的序列为如SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 40和SEQ ID NO. 43所示中的至少一种的dsRNA来防治灰飞虱（Laodelphax striatellus）；通过向所述昆虫施用正义链的序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王桂荣，杨斌，张梦君，陈婷婷，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：