一种羰基还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羰基还原酶突变体及其应用。本发明专利技术的还原酶突变体为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列定向突变制备得到。本发明专利技术突变体的催化活性好。本发明专利技术的部分突变体的e.e.≥98％和/或转化率≥95％。≥98％和/或转化率≥95％。

【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种来源于(Starmerella magnolia)的羰基还原酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]羰基还原酶的应用非常广泛，依替米贝、孟鲁斯特、度洛西汀、阿托伐他汀等药物的合成中均应用了羰基还原酶。一些酮化合物因为其特定的化学结构，还原得到目标构型手性醇化合物异常困难。对于同时有双键，酯基或卤素性质结构的底物酮，用化学方法去做不对称的还原反应，会存在比较多的问题，当两边位阻相差不大时，得到手性化合物产物的难度大，其他官能团也有可能被还原；对于有立体选择性，又有官能团选择性的反应，化学不对称还原反应相对比较困难；基于其存在的诸多问题，传统的方法主要通过化学拆分的方法来得到上述化合物的立体结构。
[0003]目前，通过酶催化的方法高选择性得到上述化合物单一构型的羰基还原产物也比较困难，现有的商品酶中，能够做这个反应的，或者手性不够，或者活性不足，或者在还原羰基的时候会同时还原双键，产生副产物。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是现有技术中的羰基还原酶在合成手性醇及其类似物时副产物较多。为此，本专利技术提供了一种来源于(Starmerella magnolia)的羰基还原酶突变体及其应用的方法。本专利技术利用目前已知的天然羰基还原酶为模板，并经过定向突变制备得到若干突变体，本专利技术羰基还原酶突变体用于催化羰基还原时催化活性好，可以以较高转化率和ee值得到S构型的还原产物。本专利技术的部分羰基还原酶突变体催化羰基还原时e.e.≥98％和/或转化率≥95％。
[0005]本专利技术提供一种的羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：
[0006]针对第14位、第15位、第16位、第46位、第89位、第91位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第98位、第109位、第113位、第142位、第143位、第144位、第145位、第146位、第147位、第148位、第149位、第150位、第151位、第152位、第153位、第154位、第157位、第158位、第160位、第161位、第170位、第173位、第185位、第186位、第187位、第188位、第189位、第190位、第191位、第192位、第193位、第194位、第195位、第196位、第197位、第198位、第199位、第200位、第201位、第202位、第203位、第204位、第208位、第209位、第210位、第212位、第215位、第234位、第235位、第236位、第237位、第238位、第239位和第240位中的一个或多个。
[0007]在某一方案中，所述制备方法中的某些条件的定义可如下所述，其他条件的定义可如上任一方案所述(以下简称“在某一方案中”)：
[0008]在某一方案中，所述多个为1到20的整数，优选为1到15的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。
[0009]在某一方案中，所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示的第14位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、T、V、W或Y，和/或，第15位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第16位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、S、T、V、W或Y，和/或，第46位氨基酸残基替换为V，和/或，第65位氨基酸残基替换为T，和/或，第89位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、K、L、M、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第91位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S或Y，和/或，第92位氨基酸残基替换为A、C、F、G、H、I、K、M、Q、R、T或Y，和/或，第93位氨基酸残基替换为C、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第94位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第95位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第96位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第98位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第109位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、H、I、K、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第113位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第142位氨基酸残基替换为A、C、D、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第143位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第144位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第145位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y，和/或，第146位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第147位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第148位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第149位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第150位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第151位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V或Y，和/或，第152位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第153位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第154位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第157位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、K、L、M、N、P、Q、R、S、V或W，和/或，第158位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第160位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第161位氨基酸残基替换为C、D、E、F、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第170位氨基酸残基替换为C、D、E、G、H、I、K、L、P、Q、T、V或W，和/或，第173位氨基酸残基替换为A、E、F、G、H、L、M、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：针对第14位、第15位、第16位、第46位、第89位、第91位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第98位、第109位、第113位、第142位、第143位、第144位、第145位、第146位、第147位、第148位、第149位、第150位、第151位、第152位、第153位、第154位、第157位、第158位、第160位、第161位、第170位、第173位、第185位、第186位、第187位、第188位、第189位、第190位、第191位、第192位、第193位、第194位、第195位、第196位、第197位、第198位、第199位、第200位、第201位、第202位、第203位、第204位、第208位、第209位、第210位、第212位、第215位、第234位、第235位、第236位、第237位、第238位、第239位和第240位中的一个或多个。2.如权利要求1所述羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体满足如下条件的一种或多种：(1)所述多个为1到20的整数，优选为1到15的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9；(2)所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示的第14位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、T、V、W或Y，和/或，第15位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第16位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、S、T、V、W或Y，和/或，第46位氨基酸残基替换为V，和/或，第65位氨基酸残基替换为T，和/或，第89位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、K、L、M、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第91位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S或Y，和/或，第92位氨基酸残基替换为A、C、F、G、H、I、K、M、Q、R、T或Y，和/或，第93位氨基酸残基替换为C、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第94位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第95位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第96位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第98位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第109位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、H、I、K、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第113位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第142位氨基酸残基替换为A、C、D、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第143位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第144位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第145位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y，和/或，第146位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第147位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第148位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第149位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第150位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第151位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V或Y，和/或，第152位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第153位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第154位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第157位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、K、L、M、N、P、Q、R、S、V或W，和/或，第158位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第160位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第161位氨基酸残基替换为C、D、E、F、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第170位氨基酸残基替换为C、D、E、G、H、I、K、L、P、
Q、T、V或W，和/或，第173位氨基酸残基替换为A、E、F、G、H、L、M、N、P、Q、S、V、W或Y，和/或，第185位氨基酸残基替换为A、C、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第186位氨基酸残基替换为A、D、E、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第187位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第188位氨基酸残基替换为A、C、D、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第189位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第190位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第191位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、L、N、P、Q、S、T、V、W或Y，和/或，第192位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、W或Y，和/或，第193位氨基酸残基替换为A、C、F、G、H、I、L、M、N、P、R、S、V、W或Y，和/或，第194位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第195位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、V、W或Y，和/或，第196位氨基酸残基替换为C、D、E、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第197位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第198位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第199位氨基酸残基替换为A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第200位氨基酸残基替换为C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第201位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第202位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第203位氨基酸残基替换为A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、V、W或Y，和/或，第204位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、N、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第208位氨基酸残基替换为A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，和/或，第209位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第210位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或W，和/或，第212位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、S、V、W或Y，和/或，第215位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第234位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、W或Y，和/或，第235位氨基酸残基替换为A、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第236位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第237位氨基酸残基替换为A、C、D、F、G、I、K、P、Q、R、S、W或Y，和/或，第238位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第239位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第240位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T...

【专利技术属性】
技术研发人员：王萍，朱露，孟枭，朱景仰，张庆，谢称福，施峰，
申请(专利权)人：上海合全药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：