一种杀虫蛋白、编码其的核酸及在防治飞虱中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种杀虫蛋白、编码其的核酸及在防治飞虱中的应用。所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2。No.2。No.2。

【技术实现步骤摘要】
一种杀虫蛋白、编码其的核酸及在防治飞虱中的应用


[0001]本专利技术涉及生物防治领域，特别涉及一种对飞虱科(Delphacidae)害虫有杀虫活性的杀虫蛋白、编码其的核酸。

技术介绍

[0002]水稻是我国最重要的粮食作物之一，其安全生产关系着国计民生。稻飞虱是水稻种植过程中主要的半翅目刺吸式口器害虫，我国为害水稻的飞虱主要有三种：灰飞虱(Laodelphax striatellus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、白背飞虱(Sogatella furcifera)。
[0003]稻飞虱属半翅目飞虱科，多在水稻茎秆处聚集成片，以成虫和若虫在水稻茎秆刺吸韧皮部汁液危害，影响水分和营养物质转运，造成空秕率上升，千粒重下降，严重影响水稻产量及品质。危害较重的是褐飞虱和白背飞虱，早稻前期以白背飞虱为主，后期以褐飞虱为主；中晚稻以褐飞虱为主。除直接取食汁液危害外，稻飞虱传播水稻病毒的危害更为严重。褐飞虱一般不会传毒，偶尔传播水稻齿叶矮缩病毒和水稻草矮病毒，但传毒率低；白背飞虱是南方水稻黑条矮缩病毒有效持久的传播载体；灰飞虱很少直接成灾，但可高效传播水稻黑条矮缩病与条纹叶枯病，传毒危害可超过其吸食稻株汁液的损失，甚至可在水稻、小麦和玉米等禾本科作物之间转主危害。
[0004]稻飞虱的防治策略中化学农药占主导地位，常用品种如吡虫啉、吡蚜酮、噻虫嗪、噻嗪酮、异丙威、呋虫胺、毒死蜱等，以新烟碱类杀虫剂为主。化学杀虫剂易造成环境污染、害虫抗药性。对于稻飞虱这类植食性刺吸式害虫，目前尚无高效的杀虫蛋白用于生物防治和转基因植物开发。

技术实现思路

[0005]本专利技术之一提供了一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2。
[0006]本专利技术之二提供了一种核酸，所述核酸能够编码如本专利技术之一所述的杀虫蛋白。
[0007]在一个具体实施方式中，所述核酸的序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]本专利技术之三提供了一种组合物，其包括如本专利技术之一所述的杀虫蛋白。
[0009]在一个具体实施方式中，所述组合物中还包括可接受的载体或助剂。
[0010]本专利技术之四提供了一种含有根据本专利技术之二中任意一项所述的核酸且能产生如本专利技术之一所述的杀虫蛋白的工程菌。
[0011]在一个具体实施方式中，所述工程菌包括芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种。
[0012]在一个具体实施方式中，所述芽胞杆菌包括苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)中的至少一种；所述假单胞菌包括荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)；所述肠杆菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0013]本专利技术之五提供了根据本专利技术之一所述的杀虫蛋白、本专利技术之三中任意一项所述的组合物和本专利技术之四所述的工程菌中的至少一种在防治害虫中的应用，所述害虫为飞虱科(Delphacidae)中的至少一种。
[0014]在一个具体实施方式中，所述害虫为灰飞虱属(Laodelphax)、褐飞虱属(Nilaparvata)和白背飞虱属(Sogatella)中的至少一种。
[0015]在一个具体实施方式中，所述害虫为灰飞虱(Laodelphax striatellus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、白背飞虱(Sogatella furcifera)中的至少一种。
附图说明
[0016]图1显示了脱盐蛋白液中的P14C11
‑
P蛋白的SDS
‑
PAGE分析结果。其中，泳道M为Marker 26614；泳道1为脱盐蛋白液中的P14C11
‑
P蛋白。
具体实施方式
[0017]以下通过优选的实施案例的形式对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本专利技术的限制。
[0018]如无特别说明，本专利技术的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
[0019]液体LB：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，pH 7.0，15磅灭菌15min。
[0020]实施例1
[0021]1.基因克隆与蛋白表达
[0022]将IPPBIOTSUC
‑
P14C11中的杀虫蛋白基因P14C11
‑
P(SEQ ID No.1，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)克隆连接到pET21b上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，转化株命名为BL21(DE3)
‑
P14C11
‑
P。
[0023]以pET21b空载转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的转化株BL21(DE3)
‑
pET21b作为蛋白表达分析的阴性对照。
[0024](1)挑取BL21(DE3)
‑
P14C11
‑
P单菌落于5mL LB液体培养基中(加入终浓度为100μg/m的氨苄抗生素)，37℃ 220rpm培养，培养8h，得到活化菌液；
[0025](2)将活化菌液转接到300mL液体LB培养基(加入终浓度为100μg/mL的氨苄抗生素)中，37℃ 220rpm培养2.5h，待OD到OD
600
为0.5
‑
0.8时，加入1mol/L IPTG 150μL；
[0026](2)调整温度至18℃，150rpm，继续培养12h，得到发酵液；
[0027](3)将发酵液4℃ 8000g离心10min；
[0028](4)弃去上清液，沉淀用30mL 20mmol/L Tris
‑
HCl pH＝8.0缓冲液重悬，转入50mL离心管，超声破碎细胞壁(功率69％，5min，超3s，停5s)，得到破碎菌液；
[0029](5)将破碎菌液4℃ 13000g离心15min，离心后的产物分为可溶性组分(上清)和不可溶性组分(沉淀，用20mmol/L Tris
‑
HCl pH＝8.0缓冲液悬浮)；
[0030](6)将上清和悬浮的沉淀进行梯度稀释后进行SDS
‑
PAGE蛋白电泳检测，结果是杀虫蛋白主要存在于可溶性组分中。
[0031]2.蛋白的纯化
[0032](1)镍亲和层析柱的制备
[0033]1)使用20％乙醇清洗空柱子，将柱料Chelating Sepharose Fast Flow(GE)摇匀
后，取2mL加入亲和层析柱子(20mL)；
[0034]2)向柱子内加入5倍柱体积的超纯水进行冲洗；
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2。2.一种核酸，所述核酸能够编码如权利要求1所述的杀虫蛋白。3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID No.1所示。4.一种组合物，其包括如权利要求1所述的杀虫蛋白。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包括可接受的载体或助剂。6.一种含有根据权利要求2或3所述的核酸且能产生如权利要求1所述的杀虫蛋白的工程菌。7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种。8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述芽胞杆菌包括苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、萎缩芽胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹蓓蓓，束长龙，孙晓妮，张杰，耿丽丽，王泽宇，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：