一种磁性DNA荧光探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及磁性ＤＮＡ荧光探针及其制备方法。该探针采用磁性核－壳型量子点ＣｄＴｅ／ＭＮｓ纳米粒子做发射荧光的能量供体，且ＣｄＴｅ／ＭＮｓ纳米粒子与单链３’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ相连接，构成ＣｄＴｅ／ＭＮｓ－ＤＮＡ；采用纳米氧化镍做吸收荧光的能量受体，且纳米氧化镍与单链５’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ相连接，构成ｎＮｉＯ－ＤＮＡ；单链５’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ与单链３’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ互补，并使ＣｄＴｅ／ＭＮｓ－ＤＮＡ与ｎＮｉＯ－ＤＮＡ杂交制成。该制备方法包括：１．制备磁性纳米粒子ＭＮｓ；２．制备ＣｄＴｅ荧光量子点溶液；３．制备ＣｄＴｅ／ＭＮｓ原液；４．制备ＣｄＴｅ／ＭＮｓ－ＤＮＡ溶液；５．ＣｄＴｅ／ＭＮｓ－ＤＮＡ溶液纯化；６．制备ｎＮｉＯ；７．制备ｎＮｉＯ－ＤＮＡ溶液；８．制备ＤＮＡ荧光探针；９．ＤＮＡ荧光探针纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程技术，具体为一种基于荧光共振能量转移原理的磁 性DNA荧光探针及其制备方法。该DNA探针可用于液体环境中检测某些具 有特征DNA序列的小分子生命物质。
技术介绍
近些年分子生物学迅猛发展，新技术不断出现，应用也日益广泛，特别 是快速、简便、准确地检测基因序列在医学临床检验学、免疫学、生物学等 研究领域中的潜在应用前景已引起国际科学界的广泛关注。对于具有特定 DNA序列的生命物质的检测，传统的方法主要是采用放射性标记和聚合酶链 式反应(PCR)的方法。由于其技术复杂，设备昂贵，使DNA检测技术的广 泛应用受到极大的限制。除了PCR技术在不断改进外， 一些新的检测方法和 技术也不断地被开发，例如生物传感技术等。目前DNA生物传感器是依据 DNA杂交原理，利用每种生物所具有的保守DNA链段的特点，通过人工设 计并合成一段与其互补的DNA探针进行检测。根据其检测方法不同，DNA 生物传感器可分为光学DNA生物传感器，压电晶体DNA生物传感器和电化 学DNA生物传感器等类型。其中光学DNA生物传感器具有非破坏性的操作 优势、较高的信号产生与读取速度，使其应用领域得到了极大地扩展，成为 应用最为普遍的生物传感器，具有广阔的应用和发展前景。光学DNA (生物)传感器主要有荧光光纤DNA传感器、荧光探针DNA 传感器、表面增强拉曼DNA传感器和表面等离子共振DNA传感器等。基于荧光标记的检测体系近年来在DNA芯片的应用已经获得认可。许多 检测方法都可以采用荧光进行，而这些检测方法主要依赖于DNA有机荧光 分子标记的供一受体对之间的能量转移。荧光共振能量转移(FRET)分析法由于其采用的仪器简单、灵敏度高，所 需样品量少，分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，己成为一种有效的痕量及超痕量分析技术。由于FRET对距离具有敏感性，能量转移荧光分 析非常适合于对环境、生物医学科学和临床化学等方面复杂、低含量组分的 分析，而且可以对无标记的目标DNA序列进行检测。因此，基于这种原理的 分析方法己被广泛地用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等 方面的研究，是基因工程中的一种新手段。对于一个成功的基于FRET的生物传感(或称做检测)体系，首要的关 键影响因素就是能量供体和受体(材料)的选择。在能量供体方面，目前大多采用有机染料作为能量的供体(甚至做能量 受体)。因为有机荧光分子对生物有很好的相容性，例如帕克，布劳德和尤 瑟卡斯等研究者先后对有机染料为能量供-受体对进行了研究，其研究结果分 别发表在《临床微生物学》(Park etal.Clin.Microbio.， 2000, 2829-2836)，《生 物技术动向》(Brudeetal. Trends in Biotechnol.， 2002, 20, 249-256)，《分析化 学》(Ysourkas et al. Anal. Chem., 2003， 75, 3697-3703)等权威刊物上。但采用 这种供一受体对仍存在以下不足l.它们的激发光谱都较窄，很难同时激发 多种组分；2.有机染料的有机荧光分子光谱较宽，分布不对称，给区分不同 探针分子的有机荧光分子来源带来困难，无法同时检测多种组分；3.需要特 定的波长激发才能发出荧光，若同时检测多种疾病，就需要用不同波长的光 激发。这样就会造成检测体系中的能量过多，不利于检测；同时不同波长激 发之间的重叠也会使各个能量供体和受体之间的能量转移变得不明显，增加 数据分析的复杂性；4.有机染料最严重的缺陷是光化学稳定性差，光漂白与 光解作用会使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量较少，光解产物又 往往会对生物体产生杀伤作用。无机纳米粒子由于其独特的物理化学性能，已经成为在生物分子的检测 和标记方面的研究热点。量子点发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调(不 同大小的纳米晶体能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光)，并具有较高 的量子效率(quantum yields;又称量子产率)和良好的化学、光学稳定性， 其荧光寿命是普通有机染料分子的100倍以上，作为能量供体已广泛应用于 荧光共振能量转移研究中。目前，国内外已有关于使用量子点作为荧光检测和荧光标记以及微生物传感器研究方面的报道，例如瓦格尼尔等研究者分别对其进行了研究，表征，其研究结果发表在《纳米通讯》杂志上(Wargnieret al，NanoLett., 2004, 78,451-457)。但是，采用有机荧光分子作为探针的能量 供-受体对也会使探针存在上述的诸多缺点。金等研究者发现使用单层巯基乙 酸包覆的核壳型CdSe/ZnS半导体发光纳米粒子(即核-壳型量子点)为能量 供体，使用有机物DABCYL作为能量受体(即淬灭剂)时，其体系的发射光 谱和吸收光谱有近90%的重叠，并成功地构建了共振能量体系，.这个结果发 表在《传感器与传动器》杂志上(Kim et al, Sensors and Actuators B， 2004, 102， 315-319)。和有机染料相比，使用CdSe/ZnS为能量供体使其荧光寿命有了较 大提高。不足之处在于，采用DABCYL作为淬灭剂，所得到的有效信号较低， 和背景信号(噪声信号)相比，其能量转移效率有待进一步提高；同时 DABCYL作为一种有机荧光染料仍然不可避免的存在上述的缺点。在能量受体选择方面也有较大进展。有研究者发现纳米级别的金具有高 的消光系数、宽的吸收光谱，对有机、无机荧光能量供体具有较高的淬灭效 果，在分子生物学、基因工程学、生物诊断等领域得到了广泛的应用。凯迪 等研究者在《分子和细胞探测器》上发表了其研究成果(Cadyetal，Mol.Cell. Probe.，2007, 21, 116-124)，分别采用Iowa Black、 Au、 DABCYL为能量受体 (淬灭剂)，以单层巯基乙酸包覆的核壳型CdSe/ZnS半导体纳米粒子为发光 粒子，对能量供体和受体的连接以及淬灭机制进行了优化和讨论。在对比实 验中发现，不同的能量供 一 受体体系与目标DNA杂交后，荧光强度是不同的， 顺序为量子点-IowaBladO量子点-Au 〉量子点-DABCYL，这表明量子点-Au 体系中量子点的发光效率有待于进一步改善。近年有研究表明，量子点-Au传感体系还存在如下不足采用CdTe、 CdS、 ZnS或者CdTe/ZnS、 CdTe/CdS等核壳型量子点为能量供体，在进行实际生物 检测时，往往得不到足够的荧光强度，严重地限制了传感体系的灵敏度。其 他相关的研究也存在相似问题，而且由于能量供-受体本身问题以及供-受体对 设计存在缺陷，造成其量子效率普遍较低，传感体系灵敏度不高。所以，上 述能量供一受体体系及探针还有待于改进。由于金是贵重金属，在实用化过程中，以金为能量受体存在成本较高的问题。所以研发使用一种高效、价廉 的化合物作为能量受体(淬灭剂)是很有必要的。对于一个成功的基于FRET的生物传感(或称做检测)体系，另外的一 个影响因素就是，在传感体系制备过程中最终获得的DNA探针的纯度问题。 DNA探针的纯度越高，FRET的生物传感体系的灵敏度就会越高，特异性就 越好。采用离心的方法虽可以部分地实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁性ＤＮＡ荧光探针，其特征在于该探针采用磁性核－壳型量子点ＣｄＴｅ／ＭＮｓ纳米粒子做发射荧光的能量供体，且ＣｄＴｅ／ＭＮｓ纳米粒子与单链３’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ相连接，构成ＣｄＴｅ／ＭＮｓ－ＤＮＡ；采用纳米氧化镍做吸收荧光的能量受体，且纳米氧化镍与单链５’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ相连接，构成ｎＮｉＯ－ＤＮＡ；所述的单链５’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ与单链３’－ＮＨ↓［２］－ＤＮＡ互补，并使ＣｄＴｅ／ＭＮｓ－ＤＮＡ与ｎＮｉＯ－ＤＮＡ杂交制成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许世超，张纪梅，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]