一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用，采用基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法构建细胞各蛋白对应的ADC复合物，通过抗体端识别靶标以及DNA端触发HCR报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并荧光成像，利用人工+计算机图像智能识别结合的细胞多色区分对多蛋白荧光成像进行区分及定量，用于体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析。本发明专利技术基于不同组合下荧光报告信号实现细胞多种蛋白同时成像，解决反复成像造成的操作繁琐、细胞变性等问题，同时结合人工与图像智能识别实现各蛋白的区分及定量分析，在多靶标、多组学分析领域具有重要应用价值。有重要应用价值。有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用。

技术介绍

[0002]基于成像的蛋白质定位法是目前对蛋白质在亚细胞尺度上进行定位和定量分析的技术之一，在探究蛋白质组的复杂结构与功能方面具有重要作用。具有可编程性的DNA免疫标记技术已被成功应用于单细胞蛋白成像分析，通过对靶标蛋白的抗体DNA标记以及随后的荧光信号输出，经过反复“成像
‑
置换”循环，可对单个细胞的多种蛋白进行多轮成像分析，但由于操作繁琐，以及反复成像造成的细胞变形、信号失真等问题仍有待解决。
[0003]杂交链式反应(HCR)由R.M.Dirks和N.A.Pierce等人于2004年首次提出，是一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术。在HCR体系中，靶分子引发两种DNA茎环交替开环，自组装得到包含大量重复单元的线性双链DNA纳米结构，具有恒温、免酶、放大效率高等优点，被广泛应用于生物传感、生物成像和生物医药领域。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一在于提供一种构建基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法(iSAFE
‑
HCR)，利用点击化学原理合成引发链DNA交联的抗体，形成抗体引物复合体(ADC)，进一步利用ADC触发HCR反应，其输出信号作为报告标签。
[0005]本专利技术的目的之二在于提供上述iSAFE
‑
HCR方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。
[0006]本专利技术的目的之三在于提供一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，采用上述iSAFE
‑
HCR方法构建细胞各蛋白对应的ADC复合物，通过抗体端识别靶标以及DNA端触发HCR报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。
[0007]本专利技术的目的之四在于提供上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法在体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析中的应用，采用上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，利用人工+计算机图像智能识别结合的细胞多色区分技术对多蛋白成像的荧光结果进行区分及定量，绘制各自对应蛋白的多色彩复合图像进行分析，针对每一种靶标确定其对应的信号标签，根据成像信号达到精准识别分析的目的。
[0008]为实现上述目的之一，本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术提供一种构建基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，包括：利用点击化学反应原理将DBCO修饰的引发链DNA(T链)与叠氮修饰的抗体进行交联，合成抗体引物复合体(ADC)，T链特异性触发HCR反应，输出的荧光信号作为报告标签对靶标进行标记；即利用点击化学原理合成引发链DNA交联的抗体，一种抗体对应一种引发链DNA，一种引
发链DNA可以引发一组HCR反应进行信号放大并输出结果，理论上n种靶标可用n种抗体标记，并对应n种信号输出结果。
[0010]优选地，以一组HCR反应元件为例，所述HCR反应元件为四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4，其序列分别如下表所示，3
’
端修饰荧光基团分别是Pacific Blue、FAM、TAMRA和Cy5，激发波长分别为405nm、488nm、560nm和633nm，分别用蓝、绿、黄和红色进行伪彩标记；
[0011][0012]通过颜色、组合或比例的不同组合方式产生的不同情况作为各靶标的报告标签，对不同靶标输出信号差异的区分。
[0013]为实现上述目的之二，本专利技术采用的技术方案是：
[0014]本专利技术提供上述iSAFE
‑
HCR方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。
[0015]为实现上述目的之三，本专利技术采用的技术方案是：
[0016]本专利技术提供一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，采用上述iSAFE
‑
HCR方法构建细胞各蛋白对应的ADC复合物，通过抗体端识别靶标以及DNA端触发HCR报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。
[0017]优选地，以6种蛋白同时孵育成像为例，6组引发链和荧光报告元件序列分别如下表所示：
[0018]表2：6组引发链和荧光报告元件序列
[0019][0020][0021]包括以下步骤：
[0022]步骤a：设计6组针对HeLa细胞中6种蛋白靶标的信号报告标签的特异性序列，并在不同的发夹上修饰荧光基团，序列如表2所示；
[0023]步骤b：将DBCO修饰的T链，即6组T链与叠氮修饰的6组靶标抗体在PBS缓冲液中反应，由于点击化学原理抗体交联DNA，得到用于引发6组HCR反应的ADC复合物；
[0024]步骤c：步骤b所得的交联抗体在固定的HeLa细胞中同时孵育，并利用步骤a所得6组H1、H2、H3和H4链在固定的HeLa细胞中同时进行HCR反应；
[0025]步骤d：步骤c所得的孵育完成的HeLa细胞通过共聚焦拍摄，获取同一HeLa细胞中多蛋白的多色成像图。
[0026]优选地，步骤b的具体步骤为：在总体积为100μL的PBS缓冲液中，将靶标对应的抗体与NHS
‑
PEG4
‑
N3交联剂按30μM:1.5mM的摩尔比在室温下1000rpm磁力搅拌2h，超滤离心纯化得到叠氮修饰的抗体；叠氮功能化的抗体与DBCO修饰的T链以10μM:100μM的摩尔比在4℃
下孵育1天，同时1000rpm磁力搅拌，多余的T链通过超滤离心去除，T链交联的抗体用1
×
PBS进行重悬，获得T链标记抗体；6组T链依次对应6种抗体，用相同方式制备得到6种用于免疫标记的DNA修饰ADC复合物。
[0027]优选地，步骤c的具体步骤为：将1
×
104HeLa细胞培养于共聚焦小皿中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；第二天弃培养液，预冷的PBS洗三次，4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗五次；皿中加入500μL 0.5％ TritonX
‑
100，37℃20min，PBS洗3次；随后皿中加入500μL 5％ BSA，室温30min，PBS洗3次；步骤b所得的6组ADC同时进行孵育，4℃过夜，PBS洗3次；随后同时加入6组终浓度为500nM的H1、H2、H3和H4链，37℃反应1.5h，反应结束后PBS洗3次。
[0028]为实现上述目的之四，本专利技术采用的技术方案是：
[0029]本专利技术提供上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法在体外肿瘤细胞中多蛋白成像检测和分析中的应用，采用上述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法对肿瘤细胞进行荧光成像，结合“人工+计算机辅助”两步法，先针对各蛋白靶标对应细胞位置人工粗略区分，再利用计算机图像智能识别软本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，其特征在于，其构建方法包括：DBCO修饰的引发链DNA(T链)与叠氮修饰的抗体进行交联，合成抗体引物复合体，T链特异性触发HCR反应，输出的荧光信号作为报告标签对靶标进行标记，得到基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法。2.根据权利要求1所述基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，其特征在于，HCR反应元件为四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4，其序列分别如SEQ ID NO:1
‑
4所示，3
’
端修饰荧光基团分别是Pacific Blue、FAM、TAMRA和Cy5，激发波长分别为405nm、488nm、560nm和633nm，分别用蓝、绿、黄和红色进行伪彩标记，T链序列如SEQ ID NO:5所示，通过颜色或比例的不同组合方式产生的不同情况作为各靶标的报告标签，对不同靶标输出信号差异化区分。3.权利要求1或2所述基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。4.一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法构建细胞各蛋白对应的抗体引物复合体，通过抗体端识别靶标以及DNA端触发HCR报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。5.根据权利要求4所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，所述细胞为HeLa细胞，采用6种蛋白同时孵育成像，包括以下步骤：步骤a：设计6组针对HeLa细胞中6种蛋白靶标的信号报告标签的特异性序列，并在不同的发夹上修饰荧光基团，其中6组引发链和荧光报告元件序列分别如下：Q1组：T链序列如SEQ ID NO:5所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:7
‑
10所示；Q2组：T链序列如SEQ ID NO:11所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:12
‑
15所示；Q3组：T链序列如SEQ ID NO:16所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:17
‑
20所示；Q4组：T链序列如SEQ ID NO:21所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:22
‑
25所示；Q5组：T链序列如SEQ ID NO:26所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:27
‑
30所示；Q6组：T链序列如SEQ ID NO:31所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:32
‑
35所示；步骤b：将6组T链与叠氮修饰的6组靶标抗体在PBS缓冲液中反应，抗体交联DNA，得到用于引发6组HCR反应的抗体引物复合体；步骤c：步骤b所得的交联抗体在固定的HeLa细胞中同时孵育，并用步骤a所得6组H1、H2、H3和H4链在固定的HeLa细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小立，孙奋勇，潘秋辉，唐晓晨，毛东升，李文星，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：