敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产ProteinA蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用。本发明专利技术通过敲除地衣芽胞杆菌BL10中sigW基因构建了重组菌株BL10ΔsigW，在此基础上引入来源于金黄色葡萄球菌重组蛋白Protein A表达载体。相比对照菌株，缺失sigW基因可以特异性提高了重组Protein A的表达量。本发明专利技术的重组Protein A可广泛用于免疫球蛋白亲和层析技术中。本本发明专利技术首次使用芽胞杆菌表达重组Protein A，无细菌内毒素产生，敲除sigW极大地提高了Protein A的产量，显著降低生产成本，为Protein A的生产提供了新的思路和方法。法。

【技术实现步骤摘要】
敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种膜蛋白，能够特异性与免疫球蛋白的Fc结构域结合。Protein A是目前研究最多的免疫球蛋白结合蛋白之一，免疫球蛋白结合蛋白是由细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白。研究表明细菌免疫球蛋白结合蛋白的抗体结合区，是由多个序列高度同源的结构域以头尾相连组成，每个单结构域具有与分子完全相同的结合特性，形成免疫球蛋白结合功能的基本单位。
[0003]天然Protein A分子量42KD，由三个部分组成，自N端开始分别为：信号肽S、Ig结合结构域和C
‑
末端X蛋白。Protein A含有五个高度同源的单结构域，自N端起分别为E、D、A、B和C，每个单结构域约含58个氨基酸残基，各结构域形成3股反向平行排列的α
‑
螺旋，可以和哺乳动物IgG抗体重链中，第二及第三恒定区间的分界面结合，以螺旋1和螺旋2与Fc的疏水作用为主，并通过两个分子之间的四对氢键得到进一步稳定。
[0004]Protein A亲和层析法是利用Protein A蛋白可与IgG上的Fc段恒定区特异性地结合，早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的IgG。但同时，天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。
[0005]但是，现有技术中的Protein A还存在以下问题：现有技术中的Protein A重组蛋白大部分是用大肠杆菌原核表达系统制备的，内毒素含量比较高，需要去除内毒素；导致现有技术中的Protein A亲和纯化技术介质价格比较昂贵，提高了实验或生产的成本。地衣芽胞杆菌是公认的生物安全菌株，被作为益生菌使用，不产生内毒素，因其具有蛋白表达能力强、抗噬菌体和杂菌污染、溶剂耐受性强、生产效率快等优势，被广泛应用于生产酶制剂，因此，地衣芽胞杆菌是目前异源蛋白工业化生产的优良宿主。
[0006]Sigma W是芽胞杆菌胞外sigma因子的一种，调节芽胞细胞胞外的一些生理活动，如生物膜的形成等。然而，其表达水平是否影响异源蛋白表达是未知的。本专利技术通过在地衣芽胞杆菌BL10中敲除sigW，显著提高了重组Protein A的表达水平，说明敲除sigW是提高地衣芽胞杆菌发酵生产Protein A水平的有效策略。

技术实现思路

[0007]本专利技术就是为了解决上述技术问题，本专利技术提供了敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用，所述的sigW基因的序列为SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术是另一个目的是提供了利用上述应用得到的Protein A蛋白的应用。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0010]敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用，包括利用本专利技术的常规方法，将地衣芽胞杆菌中的sigW基因敲除，获得地衣芽胞杆菌sigW基因缺失株，然后在该缺失株中转入Protein A表达载体后进行发酵表达即可。
[0011]以上所述的应用中，优选的，所述的Protein A为SEQ ID NO.2所示，编码其的基因为SEQ ID NO.3所示。
[0012]以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10。
[0013]以上所述的应用中，优选的，应用过程为发酵反应，发酵培养基为：20
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50g/L葡萄糖、5
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15g/L骨蛋白胨、5
‑
15g/L大豆蛋白胨、0
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20g/L玉米浆，5
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15g/L酵母粉，5
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10g/L氯化钠，2
‑
5g/L K
2 HPO4，4
‑
8g/L(NH4)2SO4，其余为水，pH 6.8～7.4。
[0014]以上所述应用过程生产的Protein A蛋白在制备亲和填料中的应用。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0016]本专利技术采用基因工程方法通过敲除地衣芽胞杆菌BL10中的sigW基因，在此菌株的基础上构建高效表达重组Protein A的重组芽胞杆菌株。相比对照菌株，Protein A的产量至少提高30％。本专利技术的重组Protein A可广泛用于免疫球蛋白亲和层析技术中。本专利技术还公开了一种由重组Protein A和琼脂糖凝胶相偶联而成的高产无内毒素抗体Protein A亲和填料。本本专利技术首次使用芽胞杆菌表达重组Protein A，无细菌内毒素产生，并通过敲除sigW基因极大地提高了Protein A的产量，显著降低生产成本，能够产生巨大的经济效益，为重组Protein A的生产提供了新的思路和方法。
附图说明
[0017]图1是本专利技术pHY
‑
Protein A重组质粒的构建。
[0018]图2是本专利技术分泌的重组Protein A蛋白的纯化图。
[0019]图3是利用本专利技术制备的重组ProteinA亲和树脂纯化人IgG蛋白的纯化图。
具体实施方式
[0020]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0021]实施例1：
[0022]sigW基因缺失株地衣芽胞杆菌BL10
△
sigW的获得：
[0023]1、根据地衣芽胞杆菌WX
‑
02(CN104630124A)基因组DNA序列中sigW基因序列，设计sigW基因的上游同源臂引物(sigW
‑
AF、sigW
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AR)和下游同源臂引物(sigW
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BF、sigW
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BR)；并以地衣芽胞杆菌WX
‑
02的基因组DNA为模板，分别以sigW基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到sigW基因的上游同源臂片段和sigW基因的下游同源臂片段；
[0024]2、通过重叠延伸PCR将sigW基因的上游同源臂和下游同源臂连接到一起，得到目的基因片段；
[0025]3、以T2质粒为模板，以引物T2
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T5
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F和T2
‑
T5
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用，应用过程包括将地衣芽胞杆菌中的sigW基因敲除，获得地衣芽胞杆菌sigW基因缺失株，然后在该缺失株中转入Protein A表达载体后进行发酵表达即可。2.根据权利要求1所述的应用，所述的Protein A为SEQ ID NO.2所示，编码其的基因为SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10。4.根据权利要求3所述的应用，应用过程中的发酵，其发酵培养基为：20
‑
50g/L葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，占杨杨，蔡冬波，谢晓梅，许海霞，王冬，李滔，
申请(专利权)人：武汉茵智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：