大豆中的豆血红蛋白制造技术

生产包含豆血红蛋白的大豆种子的大豆植物是通过修饰所述大豆植物的基因组产生的。提供了包含豆血红蛋白的大豆植物、大豆种子和大豆蛋白组合物。提供了大豆植物、大豆种子和大豆蛋白组合物，其包含豆血红蛋白并且另外地包含高油酸、低亚麻酸、高蛋白质、低水苏糖、低棉子糖和低蛋白酶抑制剂中的一者或多者。包含豆血红蛋白的蛋白组合物，例如大豆分离物和浓缩物，可以由大豆种子制成。此外，还公开了生成和使用包含豆血红蛋白的植物、种子和蛋白组合物的方法。的方法。的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大豆中的豆血红蛋白
[0001]以电子方式递交的序列表的引用
[0002]该序列表的官方副本经由EFS
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US
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PSP_SequenceListing_ST25.txt”，创建于2020年10月28日，大小为94千字节，并与本说明书同时提交。该ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。

技术介绍

[0003]用植物性蛋白替换动物性肉类正在成为食品应用的工业趋势。大豆豆科植物血红蛋白或豆血红蛋白是存在于豆科植物的固氮根瘤中的球蛋白。它携带血红素(一种含铁分子)，并且起到保护固氮酶免于氧失活以及起到促进氧气流向固氮细菌的作用。豆血红蛋白可以从工程化酵母中发酵，并通过模仿肉类中血红蛋白带来的风味而用于肉类替代品。提供了在大豆中表达豆血红蛋白的组合物和方法。

技术实现思路

[0004]提供了大豆种子，其含有占大豆种子中总蛋白的至少0.5％的量的豆血红蛋白，而不含有由整合到大豆基因组中的包含豆血红蛋白编码序列的重组构建体表达的豆血红蛋白。可对不包含含有豆血红蛋白编码序列的重组构建体的大豆种子基因组进行修饰以将插入、缺失或取代引入天然豆血红蛋白基因中，例如编码序列或调节序列，或者对其进行修饰以用豆血红蛋白编码序列替换种子贮藏蛋白的编码序列的全部或部分。
[0005]提供了大豆种子，其中对大豆种子基因组进行修饰以将插入、缺失或取代引入天然豆血红蛋白基因中或对其进行修饰以用豆血红蛋白编码序列替换种子贮藏蛋白的编码序列的全部或部分。
[0006]在一些实施例中，转运肽等靶向序列可操作地连接到豆血红蛋白编码序列以将豆血红蛋白引导至细胞内区室例如质体。
[0007]在一些实施例中，提供了包含基因组修饰的大豆种子，其中豆血红蛋白在大豆种子中以足以在种子的横切面中赋予大豆种子粉红色的量或者以占总种子蛋白的至少0.1％的量表达。
[0008]在一些实施例中，对大豆进行修饰以在种子质体中特异性地直接表达豆血红蛋白。
[0009]在一些实施例中，具有以下中的一者或多者的大豆种子进一步包含整合到其基因组中的包含豆血红蛋白编码序列的重组构建体：在天然豆血红蛋白基因中的修饰、在不同天然启动子的控制下在核基因组中豆血红蛋白基因的插入、或在质体基因组中豆血红蛋白序列的包含。
[0010]在一些实施例中，大豆种子含有进一步的修饰，例如对编码谷氨酰tRNA还原酶、铁螯合酶(ferrochelatase)、谷氨酰tRNA还原酶结合蛋白和氨基乙酰丙酸合酶的一个或多个基因中的核苷酸插入、缺失或取代。在一些实施例中，大豆种子含有一个或多个重组构建
体，该一个或多个重组构建体含有谷氨酰tRNA还原酶、铁螯合酶、谷氨酰tRNA还原酶结合蛋白和/或氨基乙酰丙酸合酶的编码序列。
[0011]提供了大豆种子，其含有占总种子蛋白的至少0.5％的量的豆血红蛋白，并且具有以下特征中的一个或多个：(i)油酸含量占总种子脂肪酸的至少50％；(ii)亚麻酸含量占总种子脂肪酸的少于3％；(iii)在13％水分下或调整至13％水分时测量的蛋白含量占大豆总重量的至少37％；(iv)Kunitz型胰蛋白酶抑制剂活性低于未修饰的对照大豆中的活性的5％；(v)Bowman
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Burke蛋白酶抑制剂活性低于未修饰的对照大豆中的活性的5％；(vi)在13％水分下水苏糖含量少于1重量％：以及(vii)在13％水分下棉子糖含量少于0.5重量％。
[0012]在一些实施例中，提供了转基因大豆种子，其含有重组构建体，该重组构建体包含编码与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性的豆血红蛋白的多核苷酸，其中该重组构建体不包含蛋白贮藏囊泡靶向序列，并且其中该大豆不含有(i)包含编码谷氨酰tRNA还原酶的序列或其截短部分的重组构建体，(ii)包含编码铁螯合酶的序列的重组构建体，(iii)包含谷氨酰tRNA还原酶结合蛋白的重组构建体以及(iv)包含氨基乙酰丙酸合酶的重组构建体，并且其中大豆种子在种子中以至少0.5％总种子蛋白的量包含豆血红蛋白。
[0013]在一些实施例中，含有占总蛋白的至少0.5％的量的豆血红蛋白的大豆种子具有基因组修饰，其包括以下中的至少一项：(i)大豆基因组序列的核酸插入，该插入排除非大豆基因组序列，(ii)一个或多个核酸取代，(iii)一个或多个核酸缺失，以及(iv)其任何组合，其中该基因组修饰包含(a)对天然豆血红蛋白基因进行的修饰或(b)包含天然豆血红蛋白基因的至少一部分的插入。
[0014]在一些实施例中，大豆表达豆血红蛋白并且进一步包含不同的修饰以减少或防止一个或多个种子贮藏编码序列的表达，例如大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。
[0015]在一些实施例中，大豆表达豆血红蛋白并且进一步包含高油酸、低亚麻酸、至少37％总种子蛋白(13％水分)中的一种或多种。
[0016]在一些实施例中，提供了从含有豆血红蛋白的修饰的大豆种子生长的植物和植物部分。
[0017]在一些实施例中，提供了用于加工从表达豆血红蛋白的修饰的大豆种子中提取的豆粕的方法，其中在足以降解豆粕中的多糖的条件下将豆粕与纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶中的至少一种接触并从残余物中过滤渗透物。提供了从修饰的大豆种子中提取的豆粕，其含有至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％总蛋白重量的豆血红蛋白。
[0018]在一些实施例中，提供了包含占总蛋白的至少0.2重量％的豆血红蛋白的大豆分离物，至少约50％的豆血红蛋白用铁基团血红素化，其从表达豆血红蛋白的修饰的种子产生。
[0019]在一些实施例中，提供了用于从包含豆血红蛋白的修饰的大豆种子和包含高油酸的大豆种子产生豆粕或分离物的方法，其中加工豆以产生包含高油酸和豆血红蛋白的豆粕或分离物，其中至少约50％的豆血红蛋白用铁基团血红素化。
[0020]附图和序列表的说明
[0021]根据下列的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本公开，所述详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
[0022]图1是显示具有或不具有不同蛋白靶向序列的大豆豆血红蛋白的表达的构建体设
计的图表。
[0023]图2是显示通过卟啉途径工程化提高大豆豆血红蛋白表达水平的构建体设计的图表。
[0024]图3是显示通过CR1/CR2 gRNA对将豆血红蛋白基因基因组工程化到天然大豆大豆球蛋白基因座中的示意图。
[0025]图4是显示通过CR1/CR3 gRNA对将豆血红蛋白基因基因组工程化到天然大豆大豆球蛋白基因座中的示意图。
[0026]图5是显示伴大豆球蛋白基因簇基因座的基因丢失(dropout)策略的示意图。
[0027]图6是蛋白凝胶的照片，显示了伴大豆球蛋白Gm10基因簇丢失变体的种子蛋白图谱。
[0028]图7是蛋白凝胶的照片，显示了伴大豆球蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种大豆种子，其包含占所述大豆种子中总蛋白的至少0.5％的量的豆血红蛋白，其中所述大豆种子不含有整合到其基因组中的包含豆血红蛋白编码序列的重组构建体。2.如权利要求1所述的大豆种子，其中已对大豆种子基因组进行修饰以将插入、缺失或取代引入到天然豆血红蛋白基因中。3.如权利要求1或2所述的大豆种子，其中已对所述大豆种子基因组进行修饰以引入(i)插入，其中所述插入包括调节增强子或启动子序列；或者(ii)取代，其中所述取代产生或增强调节增强子或启动子序列。4.如权利要求1或2所述的大豆种子，其中已对所述大豆种子基因组进行修饰以引入插入，并且所述插入包括与所述豆血红蛋白基因的豆血红蛋白编码序列可操作地连接的靶向序列，所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向细胞内区室。5.如权利要求4所述的大豆种子，其中所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向质体。6.如权利要求5所述的大豆种子，其中所述靶向序列包含编码与SEQ ID NO：32具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。7.如权利要求1所述的大豆种子，其中已对所述大豆种子基因组进行修饰以用豆血红蛋白编码序列替换种子贮藏蛋白的编码序列的全部或部分。8.如权利要求7所述的大豆种子，其中已对所述大豆种子基因组进行修饰以引入插入，并且所述插入包括可操作地连接到所述豆血红蛋白编码序列的靶向序列，所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向细胞内区室。9.如权利要求8所述的大豆种子，其中所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向质体。10.如权利要求9所述的大豆种子，其中所述靶向序列包含编码与SEQ ID NO：32具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。11.一种包含基因组修饰的大豆种子，所述基因组修饰包含将豆血红蛋白编码序列插入天然种子贮藏蛋白基因中，使得所述豆血红蛋白编码序列替换所述天然贮藏蛋白基因编码序列的全部或部分，并且其中所述豆血红蛋白在所述大豆种子中以足以在所述种子的横切面中赋予所述大豆种子粉红色的量表达。12.如权利要求11所述的大豆种子，其中所述豆血红蛋白以总种子蛋白的至少0.1％的量表达。13.如权利要求11或12所述的大豆种子，其中所述天然种子贮藏蛋白基因编码大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。14.如权利要求11至13中任一项所述的大豆种子，其中所述豆血红蛋白编码序列编码与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性的多肽。15.如权利要求14所述的大豆种子，其中所述豆血红蛋白编码序列与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性。16.如权利要求11至15中任一项所述的大豆种子，其中所述插入进一步包含可操作地连接到所述豆血红蛋白编码序列的靶向序列，所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向细胞内区室。17.如权利要求16所述的大豆种子，其中所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向质体。18.如权利要求17所述的大豆种子，其中所述靶向序列包含编码与SEQ ID NO：32具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。
19.如权利要求11至18中任一项所述的大豆种子，其中所述大豆种子进一步包含整合到其基因组中的重组构建体，所述重组构建体包含豆血红蛋白编码序列。20.如权利要求19所述的大豆种子，其中所述重组构建体包含与所述重组构建体的豆血红蛋白编码序列可操作地连接的转运序列，所述转运序列将从所述重组构建体产生的豆血红蛋白靶向细胞内区室。21.如权利要求20所述的大豆种子，其中所述转运序列将从所述重组构建体产生的豆血红蛋白靶向质体。22.如权利要求11至1 8中任一项所述的大豆种子，其中已对所述大豆种子进行修饰以使编码(i)谷氨酰tRNA还原酶、(ii)铁螯合酶、(iii)谷氨酰tRNA还原酶结合蛋白和(iv)氨基乙酰丙酸合酶的基因中具有一个或多个核苷酸插入、缺失或取代。23.如权利要求22所述的大豆，其中所述插入、缺失或取代是在所述基因的调节域中进行的。24.如权利要求22所述的转基因大豆，其中所述插入、缺失或取代是在所述基因的编码序列中进行的。25.一种包含修饰的豆血红蛋白基因的大豆种子，其中所述修饰的豆血红蛋白基因包含对天然豆血红蛋白基因的至少一个缺失、插入或取代，并且其中所述豆血红蛋白在所述大豆种子中以足以在所述种子的横切面中赋予所述大豆种子粉红色的量表达。26.如权利要求25所述的大豆种子，其中所述豆血红蛋白以总种子蛋白的至少0.5％的量表达。27.如权利要求25或26所述的大豆种子，其中所述修饰的豆血红蛋白基因包含启动子或调节增强序列的插入。28.如权利要求25至27中任一项所述的大豆种子，其中所述修饰的豆血红蛋白基因包含与所述豆血红蛋白基因的豆血红蛋白编码序列可操作地连接的靶向序列的插入，所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向细胞内区室。29.如权利要求28所述的大豆种子，其中所述靶向序列将所述豆血红蛋白靶向质体。30.如权利要求29所述的大豆种子，其中所述靶向序列包含编码与SEQ ID NO：32具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。31.如权利要求25至30中任一项所述的大豆种子，其中所述大豆种子进一步包含整合到其基因组中的重组构建体，所述重组构建体包含豆血红蛋白编码序列。32.如权利要求31所述的大豆种子，其中所述重组构建体包含与所述重组构建体的豆血红蛋白编码序列可操作地连接的转运序列，所述转运序列将从所述重组构建体产生的豆血红蛋白靶向细胞内区室。33.如权利要求32所述的大豆种子，其中所述转运序列将从所述重组构建体产生的豆血红蛋白靶向质体。34.如权利要求25至33中任一项所述的大豆种子，其中所述大豆种子进一步包含将豆血红蛋白编码序列插入天然种子贮藏蛋白基因中，使得所述豆血红蛋白编码序列替换所述天然贮藏蛋白基因编码序列的全部或部分。35.一种大豆种子，其包含占所述大豆种子中总蛋白的至少0.5％的量的豆血红蛋白，其中所述大豆进一步包括以下特征中的一个或多个：(i)油酸含量占总种子脂肪酸的至少
50％；(ii)亚麻酸含量占总种子脂肪酸的少于3％；(iii)在13％水分下或调整至13％水分时测量的蛋白含量占所述大豆总重量的至少37％；(iv)Kunitz型胰蛋白酶抑制剂活性低于未修饰的对照大豆中的活性的5％；(v)Bowman
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Burke蛋白酶抑制剂活性低于未修饰的对照大豆中的活性的5％；(vi)在13％水分下水苏糖含量少于1重量％；以及(vii)在13％水分下棉子糖含量少于0.5重量％。36.如权利要求35所述的大豆种子，其中所述大豆种子包含大豆基因组中的对天然豆血红蛋白基因的至少一个缺失、插入或取代。37.如权利要求35或36所述的大豆种子，其中所述豆血红蛋白编码序列与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性。38.如权利要求35所述的大豆种子，其中所述大豆种子包含重组构建体，所述重组构建体包含可操作地连接到豆血红蛋白编码序列的调节序列。39.如权利要求35所述的大豆种子，其中所述大豆种子包含基因组修饰，所述基因组修饰包括将豆血红蛋白编码序列插入天然种子贮藏蛋白基因中，使得所述豆血红蛋白编码序列替换所述天然贮藏蛋白基因编码序列的全部或部分。40.一种包含修饰的豆血红蛋白基因的大豆种子，其中所述修饰的豆血红蛋白基因包含对天然豆血红蛋白基因调节序列的至少一个缺失、插入或取代，并且其中所述大豆种子以0.5％总种子蛋白的量表达豆血红...

【专利技术属性】
技术研发人员：HJ，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：