本发明专利技术公开了一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物、试剂盒以及方法。所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～8所示。本发明专利技术提供的引物组可同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的特异性靶标，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，而且具有高通量特点，具有灵敏度高、经济快速、操作简单和准确性高等优点，可以广泛应用于食品行业、公共卫生行业等领域。公共卫生行业等领域。公共卫生行业等领域。
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物、试剂盒以及方法
[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物、试剂盒以及方法。
技术介绍
[0002]单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocy togenes，简称单增李斯特菌)是一种重要的兼性厌氧革兰氏食源性致病菌，可引起败血症、脑膜炎、脑膜脑炎、胸肌炎和等严重李斯特菌病，孕妇甚至导致流产等严重后果，敏感人群主要为老年人、新生儿、孕妇和免疫力低下者，致死率为20％
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30％。近年来，我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民身体健康造成一定的威胁。
[0003]单核细胞增生李斯特菌遗传多样性丰富，具有14种血清型，分别为1/2a，1/2b，1/2c，3a，3b，3c，4a，4b，4c，4ab，4d，4e，4h和7。脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis，PFGE)是单增李斯特菌分子分型的“金标准”，但随着DNA测序技术的发展，目前多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是单增李斯特菌遗传多样性分析的流行方法，其分辨力、稳定性均可与PFGE媲美，比血清分型具有更高的分辨力和可靠性。据法国巴斯德研究所BIGSdb
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Lm数据库统计，目前单增李斯特菌已发现2331序列型(sequence types，STs)(截至2020年12月15日)。单增李斯特菌具有耐受低温、低水活度、宽范围pH和高盐等能力，因此广泛存在于食品加工、水体和土壤等环境中。目前，我国许多学者报道在食品样品和临床源样本中，克隆复合群(clonal complex，CC)8型菌株均为优势型别，可能与其能够耐受一定剂量的消毒剂、强生物膜形成能力、抗氧胁迫能力等特征相关；同时有研究表明CC8型菌株是长期持续性污染食品生产加工的主要基因型，对食品安全带来严重的潜在威胁。因此，迫切需要开发一种快速检测食品和食品加工环境中CC8菌株的方法。
[0004]目前已有多种方法用于鉴定单增李斯特菌亚型，包括分子生物学方法和传统的菌落计数法。但这些方法存在一些限制，例如需要较长的操作时间、高昂的成本和较低的通量。采用MLST技术可以准确鉴定单增李斯特菌的CC型别，但目前DNA序列测定成本较高、耗时相对较长、且测序的准确性也直接影响MLST分型结果的准确性。因此，开发一种快速、高通量和低成本的方法作为单增李斯特菌亚型鉴定的替代方法是必要的。随着微生物全基因组测序技术的发展，基于比较基因组学分析获得CC型特异性DNA检测靶标，可以开发快速高通量、廉价、灵敏度高的PCR鉴定技术。
[0005]多重PCR是在同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性DNA序列靶标的PCR技术。目前已广泛应用于微生物血清分型、分子分型、病原体检测、转基因鉴定、遗传疾病诊断等生物、医学领域。多重PCR具有以下优势：(1)高通量，在一次操作中可对多达384个样品进行鉴定；(2)廉价高效，同一PCR扩增体系可同时检测多个特异性靶标，且无需进行DNA序列测定，根据靶标序列DNA条带扩增结果即可判断；(3)易于操作、耗时短，在
同一PCR反应中实现多个靶标一步法同时扩增，150min内即可获得准确结果；(4)准确性高，实现多个靶标的同步特异性扩增，大大降低了假阳性的可能性。随着引物对数量的增加，引物间的抑制作用降低了多重PCR的检测通量，在多重PCR技术的实际应用过程中，由于在同一反应管内添加多对引物，引物的非特异性扩增、引物间二聚体形成、PCR反应体系优化以达到每个靶标DNA序列都能有效扩增等问题限制了多重PCR技术的应用。
[0006]HRM qPCR是在同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性DNA序列靶标，并利用高分辨熔解曲线，一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的分析方法，同时检测多个基因的qPCR技术。HRM qPCR技术具有以下优势：(1)操作简单，同一HRM qPCR反应中实现多个靶标的同步特异性扩增及分析，实现真正的闭管操作，降低污染风险；(2)分析时间短，70min内即可获得准确结果；(3)灵敏度和特异性高，相比于PCR，HRM qPCR检测限低10至100倍，灵敏度更高。
[0007]由于目前市面上的单增李斯特菌分子检测试剂盒应用的特异性位点是基于有限的单增李斯特菌基因组数量分析得到的，我们的分析证实，在CC269和ST1197中也发现了作为CC8特异性位点的目的基因序列，而NCBI数据库中的部分CC8菌株不携带该特异性位点。因此，本专利选择了1928个属于442个ST型(123个CC型)和111个单一ST型的基因组进行更深入的全基因组分析，获得单增李斯特菌CC8型菌株特异性基因，开发高通量、高灵敏度和准确可靠的单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株多重PCR和HRM qPCR检测技术及其相应的试剂盒，对食品生产企业、检验检疫部门检测/监测单增李斯特菌污染具有重要的价值。
技术实现思路
[0008]本专利技术基于比较基因组学分析技术开发的多重PCR以及HRM qPCR技术对单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的特异性检测靶标同时进行检测，可直接鉴定单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株。
[0009]本专利技术的目的之一：提供一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2以及SEQ ID NO:5～6所示的引物。本专利技术的设计引物能够分别扩增出不同位置的目的条带，可以明显地区分单增李斯特菌和CC8型单增李斯特菌。
[0010]优选地，其中所述如SEQ ID NO:1～2所示的引物扩增的目标基因为LM5578_1180；所述如SEQ ID NO:5～6所示的引物扩增的目标基因为LM5578_2262。
[0011]本专利技术分别针对单增李斯特菌以及单增李斯特菌CC8型菌株的特异性靶标序列设计了特异性扩增引物。本专利技术之所以选择上述基因作为各型菌株的靶标，是因为基因“LM5578_1180”为CC8型单增李斯特菌株的特异性分子靶标，仅存在于CC8型单增李斯特菌株；基因“LM5578_2262”为单增李斯特菌株的特异性分子靶标。因此，当使用如SEQ ID NO:1～2以及SEQ ID NO:5～6所示的引物进行多重PCR时，PCR产物会出现两种结果：若同时出现目标基因dpnA(855bp)和ycnI(187bp)两条扩增条带，则该菌株鉴定为CC8型菌株；若只出现目标基因ycnI(187bp)一条扩增条带，则该菌株鉴定为单增李斯特菌。
[0012]本专利技术的目的之二：提供一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的qPCR引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4以及SEQ ID NO:7～8所示的
引物。本专利技术的设计引物能够分别获得两个不同本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种同时检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～8所示。2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的引物扩增的目标基因为LM5578_1180；所述核苷酸序列如SEQ ID NO:5～8所示的引物扩增的目标基因为LM5578_2262。3.用于检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的特异性靶标序列，其特征在于，所述特异性靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示。4.一种检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:5～6所示的引物组。5.一种非疾病诊断和治疗目的的检测单增李斯特菌和单增李斯特菌CC8型菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取待测菌株的基因组DNA；S2、进行多重PCR：以待测菌株的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:5～6所示的引物组扩增目的靶序列；S3、将步骤S2的扩增产物进行判定。6.如权利要求5所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，程健恒，陈谋通，陈玲，吴诗，古其会，叶青华，杨美艳，张菊梅，杨宁，陈惠元，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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