【技术实现步骤摘要】
用于表征目标多核苷酸的衔接体、方法及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求享有于2021年12月21日提交的名称为“用于表征目标多核苷酸的衔接体、方法及其用途”的中国专利申请202111573545.8的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文中。
[0003]本专利技术属于基因测序领域，涉及一种表征多核苷酸中使用的衔接体，本专利技术还涉及使用所述衔接体表征多核苷酸的方法。
技术介绍
[0004]纳米孔测序技术具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点，在长片段核酸检测变异(包括但不仅限于点突变、插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不仅限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序平台有更明显优势。该平台支持数据生产和分析并行的特点实现了实时变异/修饰检出和诊断，加上便携式的设计，使其具有广泛的应用前景。
[0005]对纳米孔两侧施加电压后，当分析物(例如多核苷酸、多肽)通过纳米孔时造成电流下降，不同结构的分析物所引起的电流阻断程度不同。当分析物在纳米孔的桶(barrel)中暂时停留一段时间时，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。
[0006]目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。>[0007]信使RNA提供了对生物体动态的观察，并且直接RNA测序的益处和应用是巨大的，包括用于健康筛查；例如某些癌症的转移过程和心脏病。直接RNA测序能在调查农作物的抗病性中应用，确定农作物对应激因素，例如干旱、紫外线和盐度的反应，以及在胚胎发育过程的细胞分化和决定中应用。
[0008]存在于RNA，特别是500个或更多的核苷酸的RNA的直接测序中的问题是寻找合适的能够控制RNA穿过跨膜孔的移位的分子马达。至今，用于RNA并提供持续移动的分子马达还没有出现。对于表征或测序多核苷酸，需要RNA聚合物的持续移动和读取长片段聚合物的能力。
[0009]国际专利申请No.PCT/GB2014/053121(WO 2015/056028)公开了表征目标核糖核酸(RNA)的方法，包括形成互补多核苷酸，然后使用跨膜孔表征所述互补多核苷酸。这种间接RNA表征易于出错并可能导致RNA的甲基化状态的重要信息的丢失。RNA到cDNA的转换过程中其他重要的修饰也可能被隐藏。
[0010]国际专利申请WO2016059436A1公开了一种纳米孔RNA表征方法。其使用DNA解旋酶表征RNA，所述DNA解旋酶通过借助非
‑
RNA前导序列的存在本质上“被欺骗地”("tricked")
读取所述目标RNA序列。一旦通过所述非
‑
RNA多核苷酸(其可以包含DNA或DNA类似物)引发所述DNA解旋酶的移动，它可以继续沿着所述RNA移动。
[0011]显然地，这两种方法都限定了目前的纳米孔RNA测序必须提供包含DNA修饰前导序列的RNA多核苷酸，这极大限制了现有RNA测序衔接体的序列多样性。
技术实现思路
[0012]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种新的衔接体，本专利技术还提供了所述衔接体的制备方法，及其用于纳米孔测序的用途。本专利技术的衔接体直接使用修饰的RNA结合解旋酶，极大地丰富了RNA测序的多样性，并为纳米孔RNA测序的进一步发展提供了很好的基础。
[0013]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0014]本专利技术的第一方面提供了一种用于表征目标多核苷酸的衔接体，所述衔接体包含解旋酶的结合区域，所述解旋酶的结合区域包含修饰的RNA多核苷酸，用于结合或装载所述解旋酶。
[0015]根据本专利技术所述的衔接体，其中，
[0016]所述解旋酶包括DNA解旋酶；和/或
[0017]所述修饰的RNA多核苷酸选自糖环2
’‑
F修饰的RNA；和/或
[0018]所述解旋酶的结合区域不包含DNA。
[0019]根据本专利技术所述的衔接体，其中，所述衔接体包含优先地穿入纳米孔的前导序列；
[0020]优选地，所述解旋酶的结合区域位于所述前导序列。
[0021]根据本专利技术所述的衔接体，其中，所述目标多核苷酸为目标RNA多核苷酸和/或目标DNA多核苷酸，优选为目标RNA多核苷酸；
[0022]所述目标多核苷酸为单链或双链；
[0023]优选地，通过共价键将所述衔接体连接到所述目标多核苷酸，所述共价键形成在所述RNA多核苷酸和所述非核苷酸的各自至少一个反应基团之间；和/或
[0024]通过化学或酶促连接将所述衔接体连接到所述RNA多核苷酸。根据本专利技术所述的衔接体，其中，所述DNA解旋酶为：
[0025]a)Hel308解旋酶、RecD解旋酶、XPD解旋酶、Dda解旋酶、Tral解旋酶、或TrwC解旋酶；
[0026]b)衍生自a)中所述任何解旋酶的解旋酶；或
[0027]c)a)和/或b)中所述解旋酶的任意组合。
[0028]本专利技术的第二方面提供了一种表征目标多核苷酸的方法，所述方法使用所述的衔接体。
[0029]根据本专利技术所述的方法，其中所述目标多核苷酸为目标RNA多核苷酸和/或目标DNA多核苷酸，优选为目标RNA多核苷酸；
[0030]所述目标多核苷酸为单链或双链；
[0031]优选地，所述方法包括：
[0032]a)提供(i)多核苷酸构建体和(ii)解旋酶，所述多核苷酸构建体包含所述目标多核苷酸和所述的衔接体；所述解旋酶包括所述的DNA解旋酶；
[0033]b)将a)中提供的所述多核苷酸构建体和所述解旋酶与跨膜孔接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔的移动；
[0034]c)随着所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
[0035]根据本专利技术所述的方法，其中，所述一个或多个特征选自(i)所述目标多核苷酸的长度，(ii)所述目标多核苷酸的同一性，(iii)所述目标多核苷酸的序列，(iv)所述目标多核苷酸的二级结构和(v)所述目标多核苷酸是否是修饰的。
[0036]根据本专利技术所述的方法，其中所述目标多核苷酸的一个或多个特征可以通过电测量和/或光测量来测量。
[0037]根据本专利技术所述的方法，其中步骤c)包括随着所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，测量流过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
[0038]根据本专利技术所述的方法，其中，所述目标RNA多核苷酸额外地或进一步通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于表征目标多核苷酸的衔接体，包含解旋酶的结合区域，所述结合区域包含修饰的RNA多核苷酸，用于结合或装载所述解旋酶。2.根据权利要求1所述的衔接体，其特征在于，所述解旋酶包括DNA解旋酶；和/或所述修饰的RNA多核苷酸选自糖环2
’‑
F修饰的RNA；和/或所述解旋酶的结合区域不包含DNA。3.根据权利要求1或2所述的衔接体，其特征在于，所述衔接体包含优先地穿入纳米孔的前导序列；优选地，所述解旋酶的结合区域位于所述前导序列。4.根据权利要求1或2所述的衔接体，其特征在于，所述目标多核苷酸为目标RNA多核苷酸和/或目标DNA多核苷酸；所述目标多核苷酸为单链或双链；优选地，通过共价键将所述衔接体连接到所述目标多核苷酸，所述共价键形成在所述RNA多核苷酸和所述非核苷酸的各自至少一个反应基团之间；和/或通过化学或酶促连接将所述衔接体连接到所述目标多核苷酸。5.一种表征目标多核苷酸的方法，所述方法使用如权利要求1至4中任一项所述的衔接体。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：a)提供(i)多核苷酸构建体和(ii)解旋酶，所述多核苷酸构建体包含所述目标多核苷酸和如权利要求1至4中任一项所述的衔接体；所述解旋酶包括DNA解旋酶；b)将a)中提供的所述多核苷酸构建体和所述解旋酶与跨膜孔接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔的移动；c)随着所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一个或多个特征选自(i)所述目标多核苷酸的长度，(ii)所述目标多核苷酸的同一性，(iii)所述目标多核苷酸的序列，(iv)所述目标多核苷酸的二级结构和(v)所述目标多核苷酸是否是修饰的。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述目标多核苷酸的一个或多个特征可以通过电测量和/或光测量来测量。9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤c)包括随着所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，测量流过所述跨膜孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述目标多核苷酸额外地或进一步通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白，或用一个或多个标记物、标签或阻断链进行修饰。11.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述目标多核苷酸可以使用一个或多个锚耦合到所述膜。12.根据权利要求6或7所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘先宇，王慕旸，常馨，
申请(专利权)人：成都齐碳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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