一种乳腺上皮细胞的培养基、培养方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种用于培养乳腺上皮细胞的培养基，其含有β

【技术实现步骤摘要】
一种乳腺上皮细胞的培养基、培养方法及其应用


[0001]本专利技术涉及用于体外培养上皮细胞、尤其是乳腺上皮细胞的培养基、以及用于培养所述细胞或包含所述细胞的类器官的培养方法。本专利技术还涉及本专利技术的培养基和培养方法所培养的细胞后代或类器官在药物的疗效评估和筛选、毒性测定和再生医学中的用途。

技术介绍

[0002]人乳腺上皮细胞的体外培养对于研究人体正常乳腺发育以及乳腺肿瘤发生发展的机制至关重要。然而，如何实现人乳腺上皮细胞的可持续培养目前仍面临诸多挑战。目前，有两种可再生技术被报道可用于人乳腺上皮细胞的体外培养：一种是由美国乔治城大学开发的条件重编程技术，另一种是由荷兰皇家艺术与科学研究院开发的类器官技术。然而这两种技术在实际应用的过程中存在着一定的问题：条件重编程技术需要将患者自体的肿瘤细胞与鼠源性饲养细胞共培养，因此会干扰对肿瘤细胞的分析结果；类器官技术所使用的培养基以干细胞龛因子为核心成分，但该培养技术所需的龛因子用量很大，成本较高，且所需的培养周期较长，操作难度大。因此，这两项技术目前均未真正大规模地推广到基础研究和新药研发领域中。
[0003]本专利技术人曾在专利(WO 2021/088119)中记载了一种无需饲养细胞、成本可控、操作便捷的体外培养乳腺上皮细胞的培养基和培养方法。这是首个无需饲养细胞，培养成分中不含Wnt蛋白、R
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spondin家族蛋白等Wnt激动剂的二维体外培养乳腺上皮干细胞的培养系统。这个培养系统可维持乳腺上皮细胞至少1个月的体外持续增殖。本专利技术人在原有专利技术的基础上，意外地发现将肿瘤坏死因子等添加剂应用于培养乳腺上皮细胞可实现更加快速地促进乳腺上皮细胞持续增殖的效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种用于培养乳腺上皮细胞的培养基及培养方法。所述培养基包括β
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雌二醇、胰岛素生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子
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α、以及任选的成纤维细胞生长因子10。
[0005]在本专利技术的实施方式中，本专利技术的培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：
[0006]β
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雌二醇的浓度为5nM～50nM，更优选为5nM～10nM；
[0007]胰岛素生长因子1的浓度为10ng/ml～200ng/ml，更优选为20ng/ml～100ng/ml；
[0008]碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～200ng/ml，更优选为20ng/ml～100ng/ml；
[0009]肿瘤坏死因子
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α的浓度为2ng/ml～100ng/ml，更优选为5ng/ml～50ng/ml；
[0010]任选添加的成纤维细胞生长因子10的浓度为0ng/ml～50ng/ml。
[0011]在本专利技术的实施方式中，本专利技术的培养基还含有双向调节素、表皮生长因子、胰岛素、B27、ROCK激酶抑制剂Y27632、神经调节素1、成纤维细胞生长因子7、TGFβI型受体抑制剂
A8301、和GlutaMAX
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I。
[0012]其中，在优选的方面，双向调节素的含量为10ng/ml～100ng/ml，表皮生长因子的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，胰岛素的含量为1μg/ml～10μg/ml，B27以1:25～1:100的体积比加入，Y27632含量为5μM～15μM，神经调节素1的含量为5nM～20nM，成纤维细胞生长因子7的含量为2.5ng/ml～20ng/ml，A8301的含量为100nM～500nM，GlutaMAX
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I以1:50～1:200体积比加入。
[0013]在本专利技术的实施方式中，所述培养基还含有选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI
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1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。
[0014]在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，当抗生素选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，当抗生素选自Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL。
[0015]本专利技术的第二方面在于提供一种乳腺上皮细胞的培养方法，其中，该培养方法包括以下步骤：(1)配制本专利技术的乳腺上皮细胞的培养基；(2)用细胞外基质胶包被培养器皿；(3)在包被好的培养器皿内接种原代乳腺上皮细胞，使用本专利技术的乳腺上皮细胞的培养基进行培养。
[0016]其中，所述培养方法中的细胞外基质胶使用低生长因子型细胞外基质胶，例如，可采用市售的Matrigel(Corning：354230)或BME(Trevigen：3533
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010
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02)。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是本专利技术的初始培养基，例如DMEM/F12(Corning：R10
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092
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CV)。细胞外基质胶的稀释比例为1:20
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400，优选为1:50
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200。包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上，优选在37℃条件下静置包被，优选包被30～60分钟。包被结束后吸弃多余的细胞外基质胶稀释液，培养器皿备用。
[0017]所述人乳腺上皮细胞可以为乳腺癌肿瘤细胞、正常乳腺上皮细胞、或乳腺上皮干细胞。例如，在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的含抗生素的DMEM/F12培养基中，冰上运输至实验室；例如，使用DMEM/F12培养基中含有50～200U/mL(例如100U/mL)青霉素和50～200μg/mL(例如100μg/mL)链霉素进行冰上运输。
[0018]在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉，并剔除组织样本表面的皮肤、筋膜等不需要的组织。
[0019]将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入5～25mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为直径小于1mm3的组织碎块。
[0020]将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机以至少1000转/分钟离心3～10分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，再用5～25mL含胶原酶II(0.5～5mg/mL，例如1mg/mL)和胶原酶IV(0.5～5mg/mL，例如1mg/mL)的无血清DMEM/F12培养基重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间为至少30分钟(消化时间取决于样本大小；如果样本大于1g，则消化时间增至1.5～2小时)；之后用台式离心机以至少300g/分钟离心3～10分钟，弃去上清液，消化后的组织细胞用5～25mL含例如10％胎牛血清的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养乳腺上皮细胞的培养基，特征在于：其含有β
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雌二醇、胰岛素生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子
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α、以及任选的成纤维细胞生长因子10。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：β
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雌二醇的浓度为5nM～50nM；胰岛素生长因子1的浓度为10ng/ml～200ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～200ng/ml；肿瘤坏死因子
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α的浓度为2ng/ml～100ng/ml。3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：β
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雌二醇的浓度为5nM～10nM；胰岛素生长因子1的浓度为20ng/ml～100ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子的浓度为20ng/ml～100ng/ml；肿瘤坏死因子
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α的浓度为5ng/ml～50ng/ml；任选添加的成纤维细胞生长因子10的浓度为0ng/ml～50ng/ml。4.如权利要求1～3中任一项所述的基，其特征在于所述培养基还含有双向调节素、表皮生长因子、胰岛素、B27、Y27632、神经调节素1、成纤维细胞生长因子7、A8301、和GlutaMAX
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I。5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于所述培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：双向调节素的含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青松，刘飞扬，张杰，陈程，王文超，
申请(专利权)人：合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：