一种制备TrkB-Tomato小鼠的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及动物模型制备领域，具体是一种制备TrkB

【技术实现步骤摘要】
一种制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及动物模型制备领域，具体地说，是一种制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法及其应用。

技术介绍

[0002]神经病理性疼痛是一种难治的疼痛，目前临床一线药物Gabapentin和Pregabalin的效果有限，且有镇静(如嗜睡、疲劳、眩晕等)的副作用。近期研究意外发现TrkB(又名Ntrk2)低阈值机械感觉神经元参与神经病理性疼痛，是治疗神经病理性疼痛可能需要靶向的细胞(Peng et.al.,MiR
‑
183cluster scales mechanical pain sensitivity by regulating basal and neuropathic pain genes.Science.2017)。因此用荧光蛋白来标记TrkB细胞将帮助筛选和/或评估靶向TrkB细胞的药物的效果。已报道用TrkB
CreERT2/+
小鼠与Rosa26
tdTomato/+
小鼠杂交得到TrkB
CreERT2/+
；Rosa26
tdTomato/+
小鼠在注射Tamoxifen后Tomato只能标记约40％的TrkB高表达的DRG神经元，而且Tomato的表达在TrkB高表达和TrkB高表达低表达的神经元中是相同的，即Tomato的表达量不能反映TrkB的表达量(Peng et.al.,MiR
‑
183cluster scales mechanical pain sensitivity by regulating basal and neuropathic pain genes.Science.2017)。因此，制备能更准确、更方便地标记更多的TrkB神经元的荧光报告小鼠将有助于筛选和研究靶向TrkB的药物。已报道TRKB基因敲除影响小鼠的生长、存活、衰老、骨骼、听觉、学习记忆、运动和多巴胺神经元的存活。
[0003]电压门控钠离子通道(Voltage
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gated sodium channel，Nav)Nav1.7和Nav1.8在疼痛调控中起非常重要的作用(A.Kanellopoulos et al.,Voltage
‑
gated sodium channels and pain
‑
related disorders.Clin Sci(Lond).2016Dec 1；130(24):2257
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2265)，但高亲和力和选择性的Nav1.7抑制剂PF
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05089771在临床研究中对神经病理性疼痛患者的镇痛效果不佳，这表明电压门控钠离子通道的IC50值不能作为临床治疗效果的评估值(Aoibhinn McDonnell，et.al.,Efficacy of the Nav1.7 blocker PF
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05089771in a randomised,placebo
‑
controlled,double
‑
blind clinical study in subjects with painful diabetic peripheral neuropathy.Pain 2018)，需要发现一个新的有效的方法来评估电压门控钠离子通道抑制剂的体内镇痛效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种评估电压门控钠离子通道抑制剂的体内镇痛效果的TrkB
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Tomato小鼠的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供TrkB
‑
Tomato小鼠及其来源的组织和/或细胞在筛选靶向TrkB细胞的药物或评估靶向TrkB细胞的药物的效果中的应用。所述的药物用于治疗和或预防TrkB细胞相关的疾病，包括但不限于发育异常、衰老、学习能力差、疼痛、瘙痒、早泄、耳聋、帕金森病等。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的第一方面，提供一种制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法，是把2A
‑
Tomato基因敲入小鼠的TrkB基因的第18个外显子的终止密码子的位置。
[0006]进一步的，所述的小鼠为C57/BL6小鼠。
[0007]进一步的，所述的2A
‑
Tomato序列如SEQ ID NO.5所示。
[0008]进一步的，除了插入2A
‑
Tomato序列之外，删除了TrkB基因第18个外显子的终止密码子“TAG”。
[0009]进一步的，所述的2A
‑
Tomato序列之后还插入如SEQ ID NO.6所示的外源序列：ACTGACCACCTAAAGGCCATGAGATCCTTGCGCCGGTGATGGTT(SEQ ID NO.6)。
[0010]进一步的，所用的Guide RNA序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示：
[0011]Guide RNA#1：CUACCUGGAUAUCCUAGGCU AGG(SEQ ID NO.3)；
[0012]Guide RNA#2：CCCGUCUACCUGGAUAUCCU AGG(SEQ ID NO.4)。
[0013]进一步的，所述的TrkB
‑
Tomato小鼠的基因敲入区域的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。TrkB
‑
Tomato小鼠中敲入的2A
‑
Tomato序列及位置见图3。其中，大写带下划线的序列是2A序列，插入在TrkB基因第18个外显子的终止密码子“TAG”位置，并删除了TrkB基因第18个外显子的终止密码子“TAG”；2A序列后小写的是Tomato编码序列，之后是外源的序列ACTGACCACCTAAAGGCCATGAGATCCTTGCGCCGGTGATGGTT(SEQ ID NO.6)，之后是TrkB基因的3
’
UTR序列。
[0014]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法包括以下步骤：
[0015](A)克隆包含5
’
同源臂
‑
2A
‑
Tomato
‑3’
同源臂的打靶载体；
[0016](B)把5
’
同源臂
‑
2A
‑
Tomato
‑3’
同源臂、Cas9和Guide RNA(SEQ ID NO.3)注射到C57/BL6小鼠的受精卵中，受精卵种植到假孕小鼠子宫中；
[0017](C)出生的F0代小鼠经PCR鉴定，阳性的F0代小鼠与野生型(WT)小鼠交配繁殖得到F1代小鼠，F1代小鼠经PCR鉴定和Southern
‑
blot鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法，是把2A
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Tomato基因敲入小鼠的TrkB基因的第18个外显子的终止密码子的位置；所述的2A
‑
Tomato序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法，其特征在于，除了插入2A
‑
Tomato序列之外，删除了TrkB基因第18个外显子的终止密码子“TAG”。3.根据权利要求1所述的制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法，其特征在于，所述的2A
‑
Tomato序列之后还插入如SEQ ID NO.6所示的外源序列。4.根据权利要求1所述的制备TrkB
‑
Tomato小鼠的方法，其特征在于，所用的Guide RNA序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。5.根据权利要求1所述的制备TrkB
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Tomato小鼠的方法，其特征在于，所述的TrkB
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Tomato小鼠的基因敲入区域的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。6.一种来源于TrkB
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Tomato小鼠的组织和/或细胞，所述的TrkB
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Tomato小鼠采用如权利要求1
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5任一所述的方法制备得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭长庚，解柔刚，孙立婷，夏瑞龙，
申请(专利权)人：上海瑞虎康医药合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：