【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】封闭端DNA载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)的用途
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年9月16日提交的美国临时申请第63/078,954号的优先权，该临时申请的全部内容据此全文以引用方式并入。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且据此全文以引用方式并入。创建于2021年9月16日的所述ASCII副本命名为131698
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08120_SL.txt，并且大小为633,329字节。
[0005]本公开涉及基因疗法领域，所述基因疗法包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如，本公开提供了使用非病毒封闭端DNA(ceDNA)载体表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)以通过在对其有需要的受试者的细胞或组织中表达PAH来治疗疾病的方法。
技术介绍
[0006]基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包括治疗或预防由可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或异常调节或表达，例如表达不足或过表达导致的医学病况。例如，由缺陷基因造成的疾病或病症可以通过向患者递送矫正性遗传物质来加以治疗、预防或改善，或可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变缺陷基因或使缺陷基因沉默，从而引起遗传物质在患者体内进行治疗性表达来加以治疗、预防或改善。>[0007]基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。此类结果可归因于治疗蛋白(例如抗体、功能性酶或融合蛋白)的表达。基因疗法也可以用于治疗由其他因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno
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associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
[0008]腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae family)，并且更具体地说，构成依赖病毒属。源自AAV的载体(即，重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减少宿主细胞对病毒感染的反应，例如干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV不同，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因并且通常持续作为附加体，因此限制
了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较差的免疫原，因此不会触发显著的免疫反应(参见ii)，从而获得载体DNA的持久性以及潜在地治疗性转基因的长期表达。
[0009]然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等人，2010)，因此，AAV载体的使用仅限于小于150,000Da的蛋白质编码能力。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出反应，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
[0010]另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人,1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫反应。
[0011]相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫反应)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒包装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
[0012]苯丙酮尿症(PKU)是一种罕见的遗传性先天性代谢缺陷，由PAH基因突变引起。苯丙酮尿症(PKU)导致苯丙氨酸的代谢降低。未经治疗，PKU可导致智力障碍、癫痫发作、行为问题和精神障碍。它还可能导致发霉的气味和较浅色的皮肤。PKU治疗不佳的母亲所生的婴儿可能有心脏问题、小头和低出生体重。PKU是由于PAH基因的突变引起的，突变导致苯丙氨酸羟化酶(PAH)水平低，即患有PKU的受试者的PAH发生突变，导致其酶活性不足。PKU是常染色体隐性遗传，这意味着该基因的两个拷贝都必须发生突变才能使病情发展。有两种主要类型，经典PKU和变异PKU，取决于是否保留任何酶功能。那些携带一个突变PAH基因拷贝的人通常没有症状。
[0013]PAH是一种酶，通常在肝脏中表达，是将膳食苯丙氨酸(phe)代谢为酪氨酸所必需的，酪氨酸是一种负责产生神经递质的氨基酸。PAH催化苯丙氨酸羟基化为酪氨酸。有缺陷的PAH酶会导致膳食苯丙氨酸积累到潜在的毒性水平。
[0014]PKU可由苯丙氨酸羟化酶(PAH)中的单基因缺陷引起，从而导致血清phe水平升高。PAH在脊椎动物中将phe转化为酪氨酸。在没有PAH的情况下，去除Phe的唯一其他机制是蛋白质合成和轻微的降解途径，涉及丙氨酸侧链的脱氨基和氧化脱羧，从而产生PKU患者尿液中所见的特征性苯乳酸和乙酸苯酯。不幸的是，典型的饮食中含有的Phe比在没有PAH的情况下可以消除的多。PKU患者体内Phe的累积导致许多症状，包括大脑发育异常和严重的智力低下。(Kaufman,Proc Nat
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l Acad Sci USA 96:3160
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3164,1999)。
[0015]目前的护理标准是严格限制饮食(限制苯丙氨酸(Phe))，但并不总是有效，因为这种饮食限制难以维持并且不能纠正潜在的缺陷。目前对PKU的治疗是减少含有苯丙氨酸和特殊补充剂的食物的饮食。严格的饮食必须在出生后尽快开始，并至少持续10年(如果不是
终生的话)。如果不及时治疗，PKU会导致进行性和严重的神经功能障碍。在美国有大约16,500人患有PKU，并且迄今为止没有解决PKU遗传缺陷的可用治疗。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：编码至少一种苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白的至少一个核酸序列，其中所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少90％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列是经密码子优化的，并且其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核苷酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1
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抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括hAAT(979)启动子和CpGmin_hAAT启动子)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少95％同一性的序列。3.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少95％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1
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抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。4.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少96％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1
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抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。5.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少97％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1
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抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。6.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少98％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1
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抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。7.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少99％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1
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抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。8.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:382所示的序列具有至少98％同一性的序列。9.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:382所示的序列具有至少99％同一性的序列。10.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:382所示。11.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:425所示的序列具有至少99％同一性的序列。12.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:425所示。13.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:431所示的序列具有至少99％同一性的序列。14.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:431所示。15.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:435所示的序列具有至少99％同一性的序列。16.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:435所示。17.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:191具有至少85％同一性的核酸序列。18.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少98％同一性的核酸序列。19.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少99％同一性的核酸序列。20.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少99％同一性的核酸序列。21.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少99％同一性的核酸序列。22.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少96％同一性的核酸序列。23.根据权利要求1至22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体还包含增强子。24.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子选自由丝氨酸蛋白酶抑制剂增
强子、3xHNF1
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4_ProEnh_10mer和5xHNF1_ProEnh_10mer组成的组。25.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子包含与SEQ ID NO:450具有至少85％同一性的核酸序列。26.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子包含与SEQ ID NO:586具有至少85％同一性的核酸序列。27.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子包含与SEQ ID NO:587具有至少85％同一性的核酸序列。28.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ ID NO:462具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。29.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ ID NO:467具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。30.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ ID NO:470具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。31.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ ID NO:470具有至少90％同一性的核酸序列的启动子组。32.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ ID NO:470具有至少95％同一性的核酸序列的启动子组。33.根据权利要求1至32中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体还包含一个或多个内含子。34.根据权利要求33所述的ceDNA载体，其中所述一个或多个内含子是小鼠微小病毒(MVM)。35.根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含3'非翻译区(3'UTR)。36.根据权利要求1至35中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个polyA序列。37.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述VD启动子包含SERP增强子。38.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述VD启动子包含3xSERP增强子。39.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是TTR肝启动子，并且所述ceDNA还包含MVM内含子。40.根据权利要求1至39中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与选自由以下组成的组的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:541、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:543、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:546、...
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