羰基还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羰基还原酶突变体及其应用。该羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括：S65；或者羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有突变的氨基酸位点，且与SEQ ID NO：1所示序列具有90％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。本发明专利技术获得了高催化效率，高选择性的羰基还原酶突变体。本申请所获得的部分羰基还原酶突变体，在合成中，酶的用量降低为0.01wt～0.03wt，反应体积降为10V～15V，使化合物的工业生产成本得到大幅度降低，使得该酶在工业生产中具有更好的应用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
羰基还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种羰基还原酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]生物催化因其具有高的立体选择性、温和的反应条件、环境友好等特点，特别近年来酶分子改造技术(生物信息学、基因工程、蛋白质工程)的飞速发展，已经成为可持续发展过程中拓展传统化学合成的重要方法。
[0003]催化酮(或醛)还原成相应的醇的酶被称为羰基还原酶(KRED)。因KRED可以高度选择性地构建手性醇，其在有机合成中的应用得到了广泛的增长。
[0004]对于外消旋手性羰基化合物，KRED对其中的一个绝对构型的催化反应速度显著快于另一个绝对构型的时候，就可以获得动力学拆分消旋体手性羰基化合物的作用。Owen W.Gooding等人通过来源于Lactobacillus kefir酶进化后选择性地将外消旋2
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甲基戊醛中的(R)构型对映体还原成目标产品(Development of a Practical Biocatalytic Process for(R)
‑2‑
Methylpentanol)。但是该研究只局限于醛类化合物，并且底物范围较窄，应用价值不高。反应如下：
[0005][0006]而KRED用于拆分外消旋手性酮的报道很少，特别是获得ee值不低于99％的酮，并同时获得ee不低于99％的醇的应用案例尚未见诸报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在提供一种羰基还原酶突变体及其应用，以提高羰基还原酶催化活性以及拆分选择性。
[0008]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种羰基还原酶突变体。该羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括：S65；或者羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有突变的氨基酸位点，且与SEQ IDNO：1所示序列具有90％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。
[0009]进一步地，S65突变为S65A、S65G或S65D。
[0010]进一步地，突变为如下突变位点组合之一：S65A+I78V、S65G+I78Q、S65D+I78V、S65A+A201Q、S65A+I78V+M154I、S65A+I78V+A201D、S65A+I78V+A201Q、S65A+P153S+V198I、S65A+I78V+M154I+A201Q、S65A+I78V+P153S+V198I、S65A+I78V+M154I+A202L、S65A+I78V+D182A+A201Q、S65A+I78V+D194A+V198I、S65A+P153S+V198I+A202L、S65A+I78V+M154I+
A201Q+A202L、S65A+I78V+P153S+V198I+A201D、S65A+I78V+S145E+P153S+D194A、S65A+I78V+M154I+A155D+A201D、S65A+I78V+M154I+V198I+A201Q+A202L、S65A+I78V+M154I+V198I+A201D+A202L、S65A+I78V+M154I+A155D+V198I+A201D+A202L、S65A+I78V+M154I+A155D+V198I+A201Q+A202L或S65A+I78V+G94T+M154I+A155D+V198I+A201Q+A202L。
[0011]根据本专利技术的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种羰基还原酶突变体。
[0012]根据本专利技术的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒连接有上述任一种DNA分子。
[0013]进一步地，重组质粒为pET
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21b(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28a(+)、pET
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29a(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、pET
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35b(+)、pET
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38b(+)、pET
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39b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42a(+)、pET
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43a(+)、pET
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43b(+)、pET
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44a(+)、pET
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49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET
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A、pRSET
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B、pRSET
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C、pGEX
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5X
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1、pGEX
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6p
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1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232
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8、pPIC9k、pGAPZαA、pUC
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18或pUC
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19。
[0014]根据本专利技术的另一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
[0015]进一步地，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0016]进一步地，原核细胞为大肠杆菌DH5α、Top10、BL21
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DE3或大肠杆菌Rosetta
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DE3细胞；真核细胞为酵母细胞。
[0017]根据本专利技术的再一方面，提供了一种生产手性酮的方法。该方法包括采用羰基还原酶对酮类外消旋体化合物还原拆分的步骤，羰基还原酶为上述任一种羰基还原酶突变体。
[0018]进一步地，酮类外消旋体化合物为其中，R1和R2各自独立地代表C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基或C5～C10碳环基，C5～C10杂环基和C5～C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列发生突变的氨基酸序列，所述突变的氨基酸位点包括：S65；或者所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有所述突变的氨基酸位点，且与SEQ ID NO：1所示序列具有90％以上同源性、具有羰基还原酶催化活性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述S65突变为S65A、S65G或S65D。3.根据权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述突变为如下突变位点组合之一：S65A+I78V、S65G+I78Q、S65D+I78V、S65A+A201Q、S65A+I78V+M154I、S65A+I78V+A201D、S65A+I78V+A201Q、S65A+P153S+V198I、S65A+I78V+M154I+A201Q、S65A+I78V+P153S+V198I、S65A+I78V+M154I+A202L、S65A+I78V+D182A+A201Q、S65A+I78V+D194A+V198I、S65A+P153S+V198I+A202L、S65A+I78V+M154I+A201Q+A202L、S65A+I78V+P153S+V198I+A201D、S65A+I78V+S145E+P153S+D194A、S65A+I78V+M154I+A155D+A201D、S65A+I78V+M154I+V198I+A201Q+A202L、S65A+I78V+M154I+V198I+A201D+A202L、S65A+I78V+M154I+A155D+V198I+A201D+A202L、S65A+I78V+M154I+A155D+V198I+A201Q+A202L或S65A+I78V+G94T+M154I+A155D+V198I+A201Q+A202L。4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的羰基还原酶突变体。5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的DNA分子。6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET
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21b(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐尤勇，范乃贵，杜平，王苑先，
申请(专利权)人：南京药石科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：