一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体及其应用。所述羧肽酶B的氨基酸序列为羧肽酶B前肽

【技术实现步骤摘要】
一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶制备
，尤其涉及一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]羧肽酶B(EC3.4.17.2，CarboxypeptidaseB，简称CPB)最先在自溶的牛和猪胰腺中发现(Folk et al，196o)，为一种外分泌蛋白酶，属于金属羧肽酶A/B家族。它可以特异性地从蛋白或多肽C端切割碱性氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。羧肽酶B在科研中的应用主要基于其切割特性，用于蛋白质和多肽的测序，在医学上常用于诊断胰腺炎；另外，在重组胰岛素的生产中，活性胰岛素的产生也依赖羧肽酶B的切割。
[0003]在自然界中绝大多数脊椎动物胰腺细胞内都能表达初级产物前羧肽酶B原(Preprocarboxypepfidase B，preproCPB)，其由三部分肽段组成，N端13～22AA的信号肽(Signal peptides)、92～95AA的前肽(propeptide)及306～309AA的酶体(enzyme moiety)。前羧肽酶B原的信号肽引导前羧肽酶B原进入胰腺细胞的分泌途径，在分泌过程中，引导肽通过蛋白水解方式被切除，从而将前羧肽酶B原转化成羧肽酶B原(羧肽酶原B)(Procarboxypeptidase B，简称proCPB)。通常在小肠内proCPB再被胰蛋白酶剪切产生无活性的前肽和有蛋白水解活性的羧肽酶B。
[0004]目前生产羧肽酶B主要通过三种方法：方法一是采用真核体系如巴斯德毕赤酵母分泌表达不具有活性羧肽酶B酶原，然后再将分泌的表达proCPB用胰蛋白酶切除前体激活得到具有活性的CPB(CN1624122A)；方法二是采用原核体系如大肠杆菌表达proCPB包涵体，然后进行复性处理和胰蛋白酶酶切激活得到活性CPB(WO 9623064)；方法三是采用原核体系如大肠杆菌表达CPB活性区域制备具有活性CBP(CN1990861A)。
[0005]方法一和方法二均需要先表达羧肽酶B酶原(proCPB)，然后经胰蛋白酶激活，再对前肽和CPB分离纯化才能得到高纯度的具有活性的CPB。比如，专利CN1624122A中虽然在胞外酶切酶原易于产生有活性的羧肽酶B，但在非变形条件下前肽仍然以非共价的方式结合至大量的羧肽酶B分子上，采用非变形纯化方法不能有效的获得高纯度无前肽的羧肽酶B。虽然该专利创新的将酶原结合在层析柱上，通过胰酶液流动酶切释放羧肽酶B，具有一定创新性，但该方法酶切效率偏低，释放出的羧肽酶B随酶切液反复循环，增加了胰蛋白酶残留的潜在风险。
[0006]方法三直接表达CPB包涵体，其未经CPB前肽辅助构象折叠，仅通过体外复性成有活性的CPB，复性率极低，复性后的活性也低，不具有产业化价值。
[0007]目前，还没有关于直接分泌表达具有活性的缩肽酶B的报道。

技术实现思路

[0008]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体及其应用，其解决了现有技术中存在的无法直接分泌表达具有活性的缩肽酶B、步
骤冗杂、纯度不高的问题。
[0009]本专利技术一方面，提供一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，所述羧肽酶B的氨基酸序列为羧肽酶B前肽
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Kex2酶切位点
‑
羧肽酶B，所述表达载体在酵母中直接表达分泌具有活性、无需体外加工的羧肽酶B。
[0010]进一步地，所述Kex2酶切位点为KR、RKR、KRKR中的一种。
[0011]进一步地，所羧肽酶B的C端还包括3
‑
6个His标签或HQ标签。
[0012]His标签为组氨酸序列，3个His标签序列为HHH、4个His标签序列为HHHH、5个His标签序列为HHHHH、6个His标签序列为HHHHHH。
[0013]HQ标签为组氨酸和谷氨酰胺交替重复的氨基酸序列，3个HQ标签序列为HQHQHQ、4个HQ标签序列为HQHQHQHQ、5个HQ标签序列为HQHQHQHQHQ、6个HQ标签序列为HQHQHQHQHQHQ。
[0014]进一步地，所述羧肽酶B具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
[0015]和/或所述编码羧肽酶B的DNA序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0016]进一步地，所述表达载体的出发载体为pPIC9、pPICZα、pPSC3K、pHIL
‑
D2中的一种。
[0017]本专利技术另一方面，提供一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体的制备方法，将编码羧肽酶B的DNA序列和用限制性内切酶酶切的出发载体相连接，得到含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，优选的，限制酶切位点为Xho I和Not I。
[0018]本专利技术另一方面，提供包括上述表达载体的宿主细胞。
[0019]进一步地，所述宿主细胞为酿酒酵母或甲基营养型酵母，优选巴斯德毕赤酵母。
[0020]本专利技术再一方面，提供上述表达载体在制备羧肽酶B中的应用。
[0021]本专利技术再一方面，提供上述宿主细胞在制备羧肽酶B中的应用。
[0022]本专利技术再一方面，提供一种制备羧肽酶B的方法，培养上述宿主细胞，使宿主细胞分泌表达羧肽酶B，在细胞培养上清中得到具有活性的缩肽酶B。
[0023]优选地，所述培养用培养基包括YPD、BMGY、BSM、FM22中的一种。
[0024]优选地，进一步包括纯化的步骤：将细胞培养上清流加至金属螯合物亲和介质，洗脱，盐析沉淀，复溶，得到羧肽酶B纯品；
[0025]更优选地，所述金属螯合物亲和介质中所用金属离子为Co
2+
、Ni
2+
、Cu
2+
、Zn
2+
中的一种，优选所述金属螯合物亲和介质为NI
‑
TED或NI
‑
NTA；
[0026]更优选地，所述盐析用盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠中的一种，优选浓度为3mol/L的硫酸铵；
[0027]更优选地，所述复溶用溶液为纯化水、磷酸盐缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液，优选25mmol/L的pH8.0的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0028]本专利技术的技术原理为：现有技术中，重组表达羧肽酶B是模拟天然羧肽酶B形成过程将羧肽酶B前肽和羧肽酶B直接连接，先表达含有前肽的羧肽酶B原，然后在胞外经胰蛋白酶酶切激活，再对前肽和CPB分离纯化才能得到高纯度的具有活性的CPB。专利技术人将现有酵母表达羧肽酶B原和大杆菌表达融合蛋白思路结合，创新性的在羧肽酶B前肽和羧肽酶B之间引入酵母菌前体加工蛋白酶kex2的酶切位点，利用酵母宿主菌内的Kex2蛋白酶在kex2酶切位点进行特异性切割去除前肽，专利技术人意外发现，该方法不仅可提高羧肽酶B的表达量，而且可以提高羧肽酶B的活性，实现了直接表达具有活性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，其特征在于：所述羧肽酶B的氨基酸序列为羧肽酶B前肽
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Kex2酶切位点
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羧肽酶B，所述表达载体在酵母中直接表达分泌具有活性、无需体外加工的羧肽酶B。2.如权利要求1所述的一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，其特征在于：所述Kex2酶切位点为KR、RKR、KRKR中的一种。3.如权利要求1所述的一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，其特征在于：所述羧肽酶B的C端还包括3
‑
6个His标签或HQ标签。4.如权利要求3所述的一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，其特征在于：所述羧肽酶B具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；和/或所述编码羧肽酶B的DNA序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。5.如权利要求1所述的一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，其特征在于：所述表达载体的出发载体为pPIC9、pPICZα、pPSC3K、pHIL
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D2中的一种。6.一种含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体的制备方法，其特征在于：将编码羧肽酶B的DNA序列和用限制性内切酶酶切的出发载体相连接，得到含有编码羧肽酶B的DNA序列的表达载体，优选的，限制酶切位点为Xho I和Not I。7.包括权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭长成，杨辉，李虹庆，程为良，
申请(专利权)人：重庆艾美迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：