一种外泌体蛋白跨膜方向的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种外泌体蛋白跨膜方向的检测方法，属于生物工程技术领域，通过基因工程的方法将Flag或HA融合到跨膜蛋白的N或C段，采用慢病毒转染的方式将融合蛋白基因整合到目的细胞的基因组中产生稳定过表达的细胞株，同时将融合蛋白整合到细胞囊泡上。通过梯度离心和超速离心方法，采用流式细胞术和Western blot鉴定Flag或HA的信号，来确定细胞外囊泡跨膜蛋白的嵌合方向。本发明专利技术方法绕开了免疫制备抗体的繁琐步骤，方法简单，耗时短，成本低廉，可靠性强。可靠性强。可靠性强。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体蛋白跨膜方向的检测方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种外泌体蛋白跨膜方向的检测方法。

技术介绍

[0002]外泌体（Exosome）是一种由细胞分泌的膜性囊泡小体，其直径通常为30
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100nm，比其它的一些囊泡（凋亡小体）要小得多。外泌体广泛存在于各种体液中，可携带蛋白质、脂类、核酸（miRNAs，ncRNAs）等多种生物功能大分子。新的研究表明，外泌体形成了一种特殊的细胞间信息传递系统，它不仅影响细胞的生理状态，而且还与多种疾病的发生与发展密切相关。外泌体领域的研究已经在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。
[0003]外泌体包含广泛的跨膜蛋白、脂质锚定的膜蛋白、外周相关的膜蛋白和外泌体腔内的可溶性蛋白(图1)。下面内容对一些较为重要和值得注意的外泌体膜蛋白进行说明。有报道证实某些四次跨膜蛋白（CD81、CD18、CD105、CD82、CD37和CD63）在外泌体中高度富集，而一般的血浆和溶酶体膜蛋白则不富集。在这些蛋白中，CD81是外泌体中最富集的蛋白；而富含内体的CD63蛋白是外泌体中也最富集的蛋白。自最初的报道以来，CD81和CD63已经成为最常用的外泌体标记蛋白。四次跨膜蛋白本身不含有催化活性，但它们促进其他膜蛋白的转运、功能、稳定性和寡聚。外泌体中存在大量的四次跨膜蛋白相关伴侣蛋白，包括主要组织相容性复合体（MHC）II类蛋白，免疫球蛋白超家族成员8（IGSF8），细胞间粘附分子
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1（ICAM
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1），这支持了四次跨膜蛋白介导其他蛋白的转导作用。
[0004]另外两种外泌体整膜蛋白：程序性死亡配体1（PD
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L1）和CD200，它们抑制抗肿瘤反应。它们包含在癌细胞来源的外泌体中，可能通过允许肿瘤来源的外泌体对远离肿瘤部位的免疫反应进行重编程，从而促进癌症免疫抑制。外泌体还包含许多其他类型的整膜信号蛋白，包括表皮生长因子受体（EGFR），肥大/干细胞生长因子受体（c
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Kit），血管内皮生长因子受体2型，胰岛素样生长因子I受体，T细胞受体，细胞因子受体，G蛋白偶联受体（GPCRs），Notch受体等。这些和其他外泌体信号分子强调，外泌体携带的跨膜蛋白可以作为表面信号分子发挥作用，此外，也可能向缺乏这些活性的细胞传递功能受体和信号通路。
[0005]目前常用的跨膜方向检测方式一是将跨膜蛋白分成跨膜区蛋白、胞外区结构域、胞内区，通过制作不同区域的特异性抗体，然后偶联相应的报告蛋白去检测。这种方法不仅需要消耗大量的时间，而且需要很大的成本。市场已有的检测抗体会相对简洁，但往往在研究中探索的大多属于未知结构，定制周期长成本高。另一方面，由于某些特殊类型的跨膜蛋白在特定区域的肽链结构较小或片段特异性差，不能产生特异性抗体，使得工作无法继续。
[0006]CN202010063756.6公开一种跨膜蛋白的检测方法，该方法是针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4
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37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行Western blot检测。本专利技术提出的跨膜蛋白检测方法，采用的蛋白提取液配方简单，性能温和，对蛋白质的结构和活性影响小，却可以高效地提取膜蛋白；且在4
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37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，可以有效保留蛋白的三级结构，对跨膜蛋白的结构功能及后续免疫学实验影响较小。但
是该方法重在检测跨膜蛋白的有无，即目的不同，另外专利技术点在跨膜蛋白的提取阶段。
[0007]CN202111457264.6公开一种3
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FLAG标签融合表达载体的制备方法及其应用，CN201810798051.1 公开一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法，上述两项专利申请都是通过一系列的酶切连接改造构建了一个全长4088bp的3
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FLAG标签，目的是创作一个通用性的标签载体。

技术实现思路

[0008]为了解决现有技术中的不足，本专利技术提供一种细胞外囊泡跨膜蛋白在质膜上的跨膜方向检测方法，通过基因工程的方法将Flag或HA融合到跨膜蛋白的N或C段，采用慢病毒转染的方式将融合蛋白基因整合到目的细胞的基因组中产生稳定过表达的细胞株，同时将融合蛋白整合到细胞囊泡上。通过梯度离心和超速离心方法，采用流式细胞术和Western blot鉴定Flag或HA的信号，来确定细胞外囊泡跨膜蛋白的嵌合方向。本专利技术方法绕开了免疫制备抗体的繁琐步骤，方法简单，耗时短，成本低廉，可靠性强。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：第一方面，本专利技术提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是在外泌体跨膜蛋白的N端与C端分别融合Flag或HA标签。进一步地，所述外泌体跨膜蛋白为CD63、CD81、CD9、CD105、CD37或CD82。更进一步地，所述外泌体跨膜蛋白的N端与C端分别通过GS序列与标签相连。优选地，所述融合蛋白的序列为SEQ ID MO：02、SEQ ID MO：04、SEQ ID MO：06、SEQ ID MO：08和SEQ ID MO：10所示序列的任意一种。
[0010]第二方面，本专利技术提供一种融合基因，所述融合基因编码上述融合蛋白。
[0011]第三方面，本专利技术提供一种重组载体，所述重组载体包含上述融合基因。
[0012]第四方面，本专利技术提供一种慢病毒，所述慢病毒采用上述重组载体构建所得。
[0013]第五方面，本专利技术提供上述融合蛋白、融合基因、重组载体或慢病毒在外泌体蛋白跨膜方向检测方面的应用。
[0014]第六方面，本专利技术提供一种外泌体蛋白跨膜方向的检测方法，包括以下步骤：将Flag或HA融合到外泌体跨膜蛋白的N或C段，获得融合蛋白；采用慢病毒转染的方式将所述融合蛋白基因整合到目的细胞的基因组中产生稳定过表达的细胞株，同时将所述融合蛋白整合到细胞囊泡上；通过梯度离心和超速离心方法，采用流式细胞术和Western blot鉴定Flag或HA的信号，确定细胞外囊泡跨膜蛋白的嵌合方向。
[0015]第七方面，本专利技术提供上述融合蛋白、融合基因、重组载体或慢病毒的应用。进一步地，所述应用包括如下至少一种：A、构建永生化和肿瘤型细胞品系；所述永生化和肿瘤型细胞品系，是由慢病毒感染生成，含有特异性基因序列和结构蛋白，如293T、Sup
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T1、Sup
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B1、raji、Daoudi、HepG2、U266等；B、获取由A构建的永生化和肿瘤型细胞品系生成的外泌体和细胞外囊泡，优选含有CD63、CD81、CD9、CD105、CD37、CD82等的N端与C端与Flag的融合蛋白结构的外泌体和细胞外囊泡；C、由B获取的外泌体和细胞外囊泡在包括生物技术在内的领域中的商业化应用。有益效果：本专利技术是通过同源重组的方式构建的目的蛋白与Flag或HA标签的融合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是在外泌体跨膜蛋白的N端与C端分别融合Flag或HA标签。2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于：所述外泌体跨膜蛋白为CD63、CD81、CD9、CD105、CD37或CD82；所述外泌体跨膜蛋白的N端与C端分别通过GS序列与标签相连。3.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的序列为SEQ ID MO：02、SEQ ID MO：04、SEQ ID MO：06、SEQ ID MO：08和SEQ ID MO：10所示序列的任意一种。4.一种融合基因，所述融合基因编码如权利要求1所述的融合蛋白。5.一种重组载体，所述重组载体包含如权利要求4所述的融合基因。6.一种慢病毒，所述慢病毒采用如权利要求5所述的重组载体构建所得。7.权利要求1
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3任意一种所述的融合蛋白、权利要求4所述的融合基因、权利要求5所述的重组载体或权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵礼军，李阳，熊建民，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：