降血压海参肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种降血压海参肽及其制备方法和应用，该方法包括将海参加水均质，得到海参匀浆；向海参匀浆加入中性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解、离心，取上清液；将上清液超滤，收集分子量≤1000Da的海参肽；将分子量≤1000Da的海参肽过SephadexG

【技术实现步骤摘要】
降血压海参肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种降血压海参肽及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]海参，又名刺参、海鼠、沙噀、海黄瓜等，是指棘皮动物门、海参纲的物种，水产上的海参系指可供食用的海参。海参体壁厚而柔软，富含胶质，与燕窝、鲍鱼、鱼翅齐名，属于海味“八珍”之一，是一种名贵的水产动物。自古以来，就有“陆有人参，海有海参”之称。海参中含有许多具有重要生物学活性的物质，包括海参毒素、海参多糖、海参皂苷、海参活性肽、脂肪酸、海参神经节苷脂等，其中海参多糖和海参皂苷具有抗癌防癌、抗肿瘤、增强机体免疫力、抗凝血、延缓衰老和抗病毒等功效，也是研究最多的两种提取自海参的活性物质。
[0003]高血压是一种常见的心血管疾病，发病率高，其对心脏、脑、肾脏等靶器官具有严重损害，治疗和预防高血压是当前社会十分重要的课题。肾素
‑
血管紧张素系统活性异常是高血压发病的主要原因，血管紧张素转换酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)对机体血压和心血管功能起到重要的调节作用。ACE在人体内的作用是把血管紧张素I(Angiotensin I Converting Enzyme)转化成血管紧张素II(Angiotensin II Converting Enzyme)，同时还会使血管舒缓激肽失活，而血管紧张素II为强烈的血管收缩物质，从而使体内血压升高。ACE是一种金属肽酶，含有1个结合Zn
2+
的位点，这是与底物结合的必须结合位点。Zn
2+
结合位点是ACE催化反应的活性基团所在部位，各种ACE抑制物的共同作用是与ACE活性部位的Zn
2+
结合，使之失活。天然蛋白质酶解产生的活性肽是ACE抑制物的主要来源，源于天然蛋白的ACE抑制物作为降压药物有着良好的应用前景。
[0004]相关技术中从海参中提取多肽的方法较为繁琐，海参多肽的含量较低，使得其不适合大规模工业生产、制备。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术的实施例在第一方面提出了一种降血压海参肽的制备方法，其包括以下步骤：
[0006](1)海参加水均质，得到海参匀浆；
[0007](2)根据3500U/g向海参匀浆加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，调节pH到6
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8，在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液；
[0008](3)将上清液超滤，收集分子量≤1000Da的海参肽；
[0009](4)分子量≤1000Da的海参肽过SephadexG
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15凝胶色谱柱，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选，收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，再利用RP
‑
C18反相高效液相色谱纯化分离，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm，洗脱液自含100％乙腈开始，至10％乙腈和90％0.1％三氟乙酸
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水
v/v的混合液结束，进行梯度洗脱，收集52％乙腈和48％0.1％三氟乙酸
‑
水v/v处的洗脱峰对应的组分，即为降血压海参肽。
[0010]根据本专利技术实施例的一种降血压海参肽的制备方法，该方法通过酶解、超滤和凝胶柱层析法从海参中制备多肽，制得的多肽的含量纯度高于80％，远高于相关技术提取的多肽含量，使得该方法可适合大规模工业生产、制备；该海参肽经分子对接、体外酶活验证得到其具有降低ACE酶活的功效。
[0011]可选地，步骤(1)中，中性蛋白酶和胰蛋白酶的比例为1:1.5。
[0012]本专利技术的实施例在第二方面提出了一种上述的降血压海参肽的制备方法制得的降血压海参肽，其氨基酸序列为FVAP。
[0013]根据本专利技术的实施例，该海参肽经分子对接、体外酶活验证得到其具有降低ACE酶活的功效。
[0014]根据本专利技术的实施例，本专利技术还提出上述的降血压海参肽在制备降血压药物中的应用，以实现海参高附加值的综合利用。
[0015]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0016]图1为根据本专利技术实施例的降血压肽的高效液相色谱图；
[0017]图2为根据本专利技术实施例的降血压肽和ACE分子对接结果示意图；
[0018]图3为根据本专利技术实施例的降血压肽ACE抑制活性图。
具体实施方式
[0019]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。
[0020]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0021]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0022]下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本专利技术。
[0023]实施例1
[0024](1)称取10g海参，进行清洗后均质，加入蒸馏水定容到50mL，根据3500U/g加入中性蛋白酶和胰蛋白酶(1.5:1)，调节pH到6，然后在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备
用。
[0025](2)利用膜过滤系统对海参活性肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的活性肽，包括≥3000Da，1000
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3000Da，≤1000Da等组分。测定结果为≤1000Da活性肽降血压活性最好。
[0026](3)凝胶柱层析：收集≤1000Da的活性组分，再用Sephadex LH
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20(长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选；收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，利用RP
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C18反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降血压海参肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)海参加水均质，得到海参匀浆；(2)根据3500U/g向海参匀浆加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，调节pH到6
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8，在50℃水温酶解6h，酶解时间结束后，沸水浴中灭酶15min，迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液；(3)将上清液超滤，收集分子量≤1000Da的海参肽；(4)分子量≤1000Da的海参肽过SephadexG
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15凝胶色谱柱，洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，通过对各组分ACE酶活性抑制试验进行筛选，收集具有最佳降血压活性洗脱峰对应的组分，再利用RP
...

【专利技术属性】
技术研发人员：林嘉珣，
申请(专利权)人：大洲新燕厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：