一种高尔基体体外培养方法及其在构建药物毒性筛选系统中的应用技术方案

本发明专利技术属于药物筛选和生物医药技术领域，具体涉及一种高尔基体体外培养方法及其在构建药物毒性筛选系统中的应用。具体的，本发明专利技术通过改进ATP再生缓冲体系并摸索合适的细胞质基质—高尔基体配比，利用蛋白免疫印迹及免疫荧光技术测定该体系下高尔基体功能相关标志物的表达，证实了在该体系下高尔基体的活性维持状态良好，并基于此培养系统进一步构建了包括雷公藤甲素等在内的多种肝毒性药物的毒效及敏感性评价平台系统。本发明专利技术极大降低高尔基体体外培养难度，缩短操作时间且可重复性强。从功能学水平反映药物肝毒性对细胞器的损伤状况，进而用于更广泛的微观层次的药物毒性及敏感性评价，因此具有良好的实际应用之价值。因此具有良好的实际应用之价值。因此具有良好的实际应用之价值。

【技术实现步骤摘要】
一种高尔基体体外培养方法及其在构建药物毒性筛选系统中的应用


[0001]本专利技术属于药物筛选和生物医药
，具体涉及一种高尔基体体外培养方法及其在构建药物毒性筛选系统中的应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]高尔基体是由多个扁平囊泡组成的具有极性的分泌性细胞器，主要负责将内质网合成的蛋白质和脂质的运输、修饰及包装到囊泡中，继而运送到细胞特定部位或分泌到细胞外。此过程是对蛋白质进行质量控制和分选的重要阶段，对维持细胞内稳态至关重要。除了作为细胞内大分子运输的一个主要交通枢纽外，高尔基体还是细胞内糖类合成的工厂，在细胞生命活动中起多种重要的作用。当药物损伤肝细胞时，细胞内高尔基体的囊泡结构会发生肿胀扩张或崩解为分散的小碎片，同时，高尔基体发挥的功能如蛋白质和脂质的分泌、运输和糖基化修饰等过程均会被抑制。因此，表征高尔基体的结构及功能可作为药物毒性筛选和评价的重要指标。
[0004]现有的体内和体外药物毒效筛选模型在应用上仍具有局限性：组织和器官水平的药物筛选评估时间周期长，成本高，操作复杂；分子和酶水平的药物筛选无法直观评价药物在体作用效果。相比以上模型，细胞及亚细胞水平的药物筛选是以整体细胞作为药物作用的对象以观察药物对整体细胞及亚细胞器的影响，是目前应用最广的药物筛选手段。相比于细胞筛选模型，亚细胞器筛选模型不仅能做到功能性筛选，而且能从更微观层面解析药物作用，对药物敏感性更高、成本更低、可操作性更强。因此，基于高尔基体在药物作用靶亚细胞器中的重要地位，建立以高尔基体为代表的体外细胞器培养体系对用于药物毒性评价筛选系统的建立有重要意义。
[0005]目前，高尔基体的体外培养方式主要是通过将提取后的高尔基体膜与不同的因子或缓冲溶液进行分阶段孵育及向培养体系中添加多种细胞因子以诱导体外培养。然而，专利技术人发现，(1)现有高尔基体培养体系复杂且重现性差，仅通过ATP、多种无机盐的化学缓冲液体系维持高尔基体活性；(2)现有高尔基体培养体系难以维持其完整的结构及活性，因而应用效果较差，并没有广泛应用于的体外毒性药物筛选。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术的不足，专利技术人经长期的技术与实践探索，提供一种高尔基体体外培养方法及其在构建药物毒性筛选系统中的应用。本专利技术通过改进ATP再生缓冲体系并摸索合适的细胞质基质—高尔基体配比，利用蛋白免疫印迹、免疫荧光技术以及投射电镜测定该体系下高尔基体形态及功能相关标志物的表达，证实了在该体系下高尔基体的活
性维持状态良好，并基于此培养系统进一步构建了包括雷公藤甲素、二苯乙烯苷、大黄酚、淫羊藿次苷I在内的多种肝毒性药物的毒效及敏感性评价平台系统。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种高尔基体体外培养方法，所述培养方法包括利用自体原代细胞分离提取高尔基体，向其中加入细胞质基质溶液，从而完成高尔基体和细胞质基质组装，进而向其中加入ATP支持系统溶液；
[0009]其中，所述细胞质基质溶液取自与高尔基体同一组织来源。
[0010]所述ATP支持系统溶液包含磷酸肌酸、ATP、细胞松弛素B和肌酸激酶。
[0011]本专利技术的第二个方面，提供上述培养方法在构建药物毒性筛选系统中的应用。
[0012]具体的，所述应用为构建肝毒性药物筛选系统；所述肝毒性药物包括但不限于二苯乙烯苷、大黄酚、淫羊藿次苷I和雷公藤甲素。
[0013]本专利技术的第三个方面，提供一种肝毒性药物筛选系统，所述系统经由上述高尔基体体外培养方法构建获得，肝毒性药物筛选系统运行使用时，将待测药物与上述缓冲溶液预混合，然后将含待测药物的缓冲溶液加入其中，筛选时间可以控制为6小时。
[0014]与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：
[0015]1、上述技术方案优化了目前复杂的体外高尔基体细胞器ATP供能系统，创新性采用活性因子复配特定比例细胞质基质的方式，实现高尔基体在无细胞结构支持下更全面的基本功能的维持。
[0016]2、上述技术方案通过选用同一小鼠肝脏提取和分离高尔基体和细胞外基质，这种自体原代组织分离组装高尔基体技术更稳定并贴近体内实际生理环境。
[0017]3、上述技术方案基于高尔基体体外培养系统，开发了高通量新药物毒性筛选平台，缩短了筛选时间，实现了大规模体外筛选的可能，同时降低了筛选成本，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0018]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0019]图1为本专利技术实施例中获得的高尔基体电镜图，其比例尺为500nm。
[0020]图2为本专利技术实施例中高尔基体与细胞质基质在1：25配比下其功能实现情况。GM130为高尔基体顺式表面上的高尔基体整形蛋白；Golgin
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45(Gol45)为高尔基体反式表面上的螺旋线圈蛋白；Syntaxin 6为高尔基体结构相关蛋白，与高尔基体易位相关，可作为高尔基体内参；COPB为囊泡标志物，可作为囊泡运输情况参考。
[0021]图3为本专利技术实施例中高尔基体在不同培养体系下结构与功能维持情况。GM130为高尔基体顺式表面上的高尔基体整形蛋白；Golgin
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45(Gol45)为高尔基体反式表面上的螺旋线圈蛋白；Syntaxin 6为高尔基体结构相关蛋白，与高尔基体易位相关，可作为高尔基体内参；COPB为囊泡标志物，可作为囊泡运输情况参考。
[0022]图4为本专利技术实施例中高尔基体对潜在肝毒性药物评价效果对比。GM130为高尔基体顺式表面上的高尔基体整形蛋白；Golgin
‑
45(Gol45)为高尔基体反式表面上的螺旋线圈
蛋白；Syntaxin 6为高尔基体结构相关蛋白，与高尔基体易位相关，可作为高尔基体内参；COPB为囊泡标志物，可作为囊泡运输情况参考。
[0023]图5为本专利技术实施例中HepG2细胞在给予不同已报道肝细胞损伤药物后，高尔基体功能维持情况。GM130为高尔基体顺式表面上的高尔基体整形蛋白；Golgin
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45(Gol45)为高尔基体反式表面上的螺旋线圈蛋白；Syntaxin 6(Syn6)为高尔基体结构相关蛋白，与高尔基体易位相关，可作为高尔基体内参；β
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actin为细胞骨架内参；COPB为囊泡标志物，可作为囊泡运输情况参考。
[0024]图6为本专利技术实施例中高尔基体在药物TP作用下高尔基体相关标志物荧光染色情况。其中，Syntaxin 6为高尔基体结构相关蛋白，与高尔基体易位相关，可作为高尔基体内参；COPB为囊泡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高尔基体体外培养方法，其特征在于，所述培养方法包括利用自体原代细胞分离提取高尔基体，向其中加入细胞质基质溶液，从而完成高尔基体和细胞质基质组装，进而向其中加入ATP支持系统溶液；所述细胞质基质溶液取自与高尔基体同一组织来源；所述高尔基体和细胞质基质溶液中总蛋白质量比为1：20
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30；所述ATP支持系统溶液包含磷酸肌酸、ATP、细胞松弛素B和肌酸激酶。2.如权利要求1所述的高尔基体体外培养方法，其特征在于，所述高尔基体和细胞质基质溶液中总蛋白质量比为1：25；所述利用自体原代细胞分离提取高尔基体具体包括选用非人动物肝脏组织获取所述高尔基体；具体方法如下：向缓冲液中加入经预处理后的新鲜非人动物肝脏组织，破碎后进行洗涤，加入试剂A，匀浆并进行第一次离心，去除沉淀，获取上清后进行第二次离心，然后去除沉淀，获取上清后继续进行第三次离心，去除沉淀，向上清液中加入WT溶液继续进行第四次离心，弃上清，留沉淀，在沉淀中加入试剂B，混匀；进行第五次离心，沉淀即为高尔基体；所述试剂A、试剂B和WT溶液均选自市售高尔基体提取试剂盒。3.如权利要求2所述的高尔基体体外培养方法，其特征在于，所述非人动物选自非人哺乳动物，包括大鼠、小鼠、猴、猩猩。4.如权利要求2所述的高尔基体体外培养方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述预处理为使用PBS缓冲液洗涤肝脏组织。5.如权利要求2所述的高尔基体体外培养方法，其特征在于，第一次离心具体条件为在500
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1500g条件下离心1
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10分钟；第二次离心具体条件为在2000
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4000g条件下离心5
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20分钟；第三次离心具体条件为在4000
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6000g条件下离心5
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20分钟；第四次离心具体条件为在10000
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30000g条件下离心10
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30分钟；第五次离心具体条件为在10000
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30000g条件下离心10
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60分钟。6.如权利要求1所述的高尔基体体外培养方法，其特征在于，所述细胞质基质溶液其制备方法如下：将经预处理后的非人动物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓骄阳，刘闰平，曲姣蓉，丁明宁，孙蓉，吴建芝，龚立平，刘佳，杜航，吴恺怿，沈显辉，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：