本发明专利技术提供一种百白破、Ａ＋Ｃ群脑膜炎球菌－ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗，采用Ａ、Ｃ群脑膜炎奈瑟氏双球菌、ｂ型流感嗜血杆菌培养液，分别提取荚膜多糖，经过纯化、活化后，与破伤风类毒素结合，然后将Ａ、Ｃ群脑膜炎多糖结合疫苗原液、ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百白破原液按一定比例混合，获得一针多种免疫的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，用吸附 无细胞百白破联合疫苗、AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，预防脑脊髓 膜炎、肺炎、百日咳、白喉及破伤风等重要疫病，属于疫苗生产制备
技术介绍
流行性脑脊髓膜炎(流脑)主要发病人群是婴幼儿，A、 C群脑膜炎球菌多糖结合 疫苗主要用于婴幼儿预防使用。二十世纪八十年代，随着流脑多糖疫苗开发成功和纳 入计划免疫，全球范围内接种人数逐年上升，发病率逐年下降。我国的流脑发病以A 群为主，因此开发的疫苗均为A群多糖或A+C群双价多糖疫苗，但是2000年在贵州、 2004年在河北分别爆发了流脑，造成当地的恐慌，经流行病学调査证明，引起流行的 是C群菌株，这就引起了疾病控制部门的重视。现行A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗安全， 有效，保护率可达80-90%。但该疫苗对2岁以下婴幼儿免疫效果差，接种一剂不能达 到抗体保护水平，且抗体很快消失。因该疫苗与其它多糖疫苗一样，属T细胞非依赖 性抗原，2岁以下婴幼儿免疫系统尚未发育成熟.，对大多数荚膜多糖的抗体应答反应较 弱，仅产生低水平的特异性抗体，多糖结合物可刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合 成，并可加强应答，与非结合物疫苗相比还提高了免疫球蛋白(IgG)的抗体比例。b型流感嗜血杆菌(Hib)通过飞沫传播感染，引起五岁以下儿童鼻咽炎、会咽炎 等原发性疾病；细菌从局部进入血液或通过血脑屏障，引起肺炎、化脓性脑膜炎、关 节炎、骨髓炎、心包炎和败血症等严重的侵袭性疾病。WHO指出全世界每年有300万例 的Hib感染，其中死亡6万例(2%)，在发达国家以脑膜炎为主，在发展中国家以肺炎 为主。鉴于A、 C群脑膜炎球菌和b型流感嗜血杆菌引起疾病的严重性和疫苗的有效性， 研发该疫苗具有极其重要的意义。在目前已使用Hib疫苗的38个国家中，其免疫程序 遵照的原则是l)在出生后2-6月龄之间完成基础免疫程序，每剂注射间隔至少l个 月；2)出生后12-24个月之间可以进行一次加强免疫。遵照这一原则，用吸附无细胞 百白破联合疫苗、AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，于出生后2-6月龄 之间完成基础免疫，12-24个月之间完成加强免疫。按该免疫程序可同时预防A、 C群的疾病、百日咳、白喉和破伤风，同时减少儿童免疫次数。
技术实现思路
本专利技术提供一种百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，采用A、 C群脑膜炎奈瑟氏双球菌、b型流感嗜血杆菌培养液，分别提取荚膜多糖，经过纯化、 活化后，与破伤风类毒素结合，然后将A、 C群脑膜炎多糖结合疫苗原液、b型流感嗜 血杆菌结合疫苗原液与无细胞百白破原液按一定比例混合，获得一针多种免疫的效果。本专利技术联合疫苗含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖10y gC群脑膜炎球菌多糖10ugb型流感嗜血杆菌多糖乳糖2. 5 3. 0mg无细胞百日咳原液18y gPN/ml白喉类毒素-25Lf/ml破伤风类毒素7 Lf/ml氢氧化铝含量1. 0 1. 5mg/ml本专利技术联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤1. 菌种的的选用选用A、 C群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于A、 C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备。2. 生产用种子启开工作种子批菌种，经适当传代，经检定合格后，接种改良半综合培养基或其 他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。3. 生产用培养基采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有与十六烷基 三甲基溴化铵形成沉淀的成分。4. 培养采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检， 如发现污染杂菌，应废弃。5. 收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检 查，合格后在收获的培养液中加入甲醒溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌 安全又不损伤其多糖抗原为宜。6. 去核酸将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基 溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为 lmol/L，使多糖十六垸基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%， 2—8。C静 置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。7. 沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%,充分振摇，离心收集沉淀，用 无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待 纯化。8. 多糖纯化将粗制品溶解于1 / 10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10 — 20mg/ml;按1: 2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1 / 10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集 上清液，并用0. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75% 80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶 解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行9. 多糖活化、衍化与破伤风类毒素结合将理化检定合格的多糖经溴化氰活化，加入适宜比例的ADH (1、 6—己二酰肼)反 应过夜，然后用超虑或其他适宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH,过滤除菌，-2(TC保 存。取样进行检定，检定合格后，将适宜浓度的多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等量 混合，然后加入EDAC (碳二亚胺)，混合物2-8。C保持一定时间，用0.2MNaCl溶液透 析过夜，将反应物用S印harose CL-4B柱层析纯化，收集V。部分洗脱液，用NaOH调 pH至中性，除菌过滤，既为结合物原液，2-8t:保存。10. 半成品配制及分装将检定合格的A、 C群脑膜炎球菌多糖结合苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原 液与无细胞百日咳原液按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0. 5mL/瓶，放2-8。C库待检。11.成品检定根据拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》及现行 的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的相关要求进行全面检定。 本专利技术优点在于1. 无细胞百白破联合疫苗中含有氢氧化铝，作为佐剂成分，有如下特点1)吸附 率高，第一针注射后即可达到快、高和持续久的免疫效果；2)适量的铝佐剂可逐步释 放抗原，较长时间刺激免疫细胞；3)刺激体液免疫，产生更高滴度的IgG、 IgE，激活Th2细胞。本专利技术巧妙利用佐剂氢氧化铝，制成百白破+八(:群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，接种人体后，不仅增强百白破免疫效果，还能增强A、 C群脑膜炎球 菌-Hib结合疫苗免疫效果。2. 接种一针就可以预防流行性脑脊髓膜炎、Hib导致的疾病、百日咳、白喉和破伤风；3. 提高疫苗覆盖率和接种率，减少儿童多次注射疫苗所带来的的痛苦，降低接种 和管理上的费用，减少家长、儿童和医生的不便和工作量。具体实施例方式实施例1 :200901批百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备1、 取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血杆 菌58534菌株，接种于适宜琼脂培养基，于35 — 37'C二氧化碳的环境中培养16—20 小时，涂片做革兰氏染色镜检，接种发酵罐培养。2、 采用培养罐液体培本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种百白破、Ａ＋Ｃ群脑膜炎球菌－ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品含以下组分及含量： Ａ群脑膜炎球菌多糖： １０μｇ Ｃ群脑膜炎球菌多糖： １０μｇ ｂ型流感嗜血杆菌多糖： １０μｇ 乳糖： ２．５～３．０ｍｇ 无细胞百日咳原液： １８μｇＰＮ／ｍｌ 白喉类毒素： ２５Ｌｆ／ｍｌ 破伤风类毒素： ７Ｌｆ／ｍｌ 氢氧化铝含量： １．０～１．５ｍｇ／ｍｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙惠军，牟盈盈，梁艳婷，李冲，巨爽，杨宗辉，
申请(专利权)人：长春长生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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