超敏C-反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法技术

本申请提供一种超敏C

【技术实现步骤摘要】
超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及体外诊断免疫层析领域，涉及超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清、血浆以及全血样本中的超敏C
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反应蛋白含量。

技术介绍

[0002]超敏C
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反应蛋白(hsCRP)是组织损伤后机体产生的一种急性时相蛋白，其浓度水平与炎症反应、组织损伤程度大致呈正比；hsCRP参与粥样硬化的形成，与冠心病类型、粥样斑块稳定性有关，可用来预测冠脉事件的再发风险，对急性冠脉缺血及冠脉介入术后的预后具有重要的判断价值；也可作为糖尿病患者早期肾损伤的一个灵敏的标志物。
[0003]目前临床诊断应用最广泛的是采用进口试剂检测血清和血浆中的人超敏C反应蛋白(hsCRP)，包括化学发光免疫法和酶联荧光法；化学发光免疫法釆用抗C反应蛋白抗体作为包被抗体，该检测方法建立后，即广泛用于细菌和病毒感染的鉴别诊断，从而让临床医生制定医学治疗措施，包括抗生素治疗；治疗启动后，超敏C反应蛋白(hsCRP)的检测有助于判断治疗效果；该方法灵敏度和特异性高，操作复杂，费时，不宜作为献血人员的筛查，只能用作确证试验；同时，该方法需要特殊设备、操作人员需要专门的操作技能、一次测试从采样到孵育、洗板、显色需要很长时间，浪费大量人力物力，难以在缺少设备的边远山区、基层医院、诊所开展；而荧光定量免疫层析技术，是免疫荧光技术和传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术，该技术在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量，荧光定量免疫层析技术相对上述三者来说具有高特异性、高灵敏度、高准确性、高抗干扰性以及投入成本低，检测速度快等适合床旁使用的特点，现急需一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清、血浆以及全血样本中的超敏C
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反应蛋白含量的试剂盒。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、检测时间短、特异性强、准确性好以及稳定性高的用于辅助评价超敏C
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反应蛋白含量的超敏C
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反应蛋白含量荧光免疫层析法测定试剂盒。
[0005]本申请采用如下方案，超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，
[0006]检测线上包被有CRP单克隆抗体，包被浓度为0.8
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1.2mg/ml；
[0007]质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8
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1.2mg/ml；
[0008]所述结合垫上喷涂有荧光微球标记的抗体溶液，荧光微球标记的抗体溶液具体为：荧光微球标记CRP抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液。
[0009]优选的，所述荧光微球标记CRP标记抗体溶液，配制步骤如下：
[0010]a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
[0011]b.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
[0012]c.进行离心30min，离心转速为10000rpm，弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
[0013]d.加入CRP标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；
[0014]e.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
[0015]f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
[0016]g.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀。
[0017]优选的，所述荧光微球和CRP标记抗体的投料比为20:1。
[0018]优选的，所述荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液，配制步骤如下：
[0019]a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
[0020]b.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
[0021]c.进行离心30min，离心转速为10000rpm,弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
[0022]d.加入羊抗鸡IgY抗体16μg混匀，旋转混匀反应30min；
[0023]e.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
[0024]f.离心30min,弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
[0025]g.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀。
[0026]优选的，所述荧光微球和羊抗鸡IgY抗体的投料比为20:1。
[0027]优选的，CRP标记抗体的标记量为0.4
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0.6μg/μL，羊抗鸡IgY标记抗体标记量为0.6
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0.9μg/μL。
[0028]优选的，包被工作液喷量为0.8
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1.2μL/cm；标记抗体溶液喷量为4
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6μL/cm。
[0029]优选的，标记用荧光微球为南京微测生物公司粒径为300nm的Eu
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荧光纳米微球。
[0030]优选的，稀释液的配方为：0.01M pH为7.4的PBS溶液以及0.05％的Proclin300溶液的混合物。
[0031]本申请的另一目的是提供一种超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0032]步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将CRP单克隆抗体、鸡IgY抗体分别按0.8
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1.2mg/mL和0.8
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1mg/mL的包被浓度配制包被工作液，按0.8
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1.2μL/cm的喷量，将两者划到NC膜上的检测线和质控线上后干燥；
[0033]步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液用喷金划线机按照4
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6μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
[0034]步骤3：样品垫经样品垫处理液处理好后干燥；
[0035]步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次粘贴在PVC板上，组装成试剂卡。
[0036]本试剂盒测定的原理：采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理，测试时，将样本与稀释液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，在毛细效应作用下进行层析，样本中的CRP抗原与荧光标记CRP抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的CRP单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒，包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括PVC板以及依次设于所述PVC板上的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，其特征在于，检测线上包被有CRP单克隆抗体，包被浓度为0.8
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1.2mg/ml；质控线上包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8
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1.2mg/ml；所述结合垫上喷涂有荧光微球标记的抗体溶液，荧光微球标记的抗体溶液具体为：荧光微球标记CRP抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液。2.根据权利要求1所述的超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述荧光微球标记CRP标记抗体溶液，配制步骤如下：a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；b.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；c.进行离心30min，离心转速为10000rpm，弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；d.加入CRP标记抗体10μg混匀，旋转混匀反应30min；e.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；f.离心30min，弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；g.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀。3.根据权利要求2所述的超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述荧光微球和CRP标记抗体的投料比为20:1。4.根据权利要求1所述的超敏C
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反应蛋白荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液，配制步骤如下：a.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL，取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；b.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；c.进行离心30min，离心转速为10000rpm,弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；d.加入羊抗鸡IgY抗体16μg混匀，旋转混匀反应30min；e.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；f.离心30min,弃去上清液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王胜岚，彭永林，李峰，
申请(专利权)人：派恩特中山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：