LC-MS/MS测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种LC

【技术实现步骤摘要】
LC
‑
MS/MS测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法


[0001]本专利技术涉及药物分析
，具体涉及一种液相色谱串联质谱法(LC
‑
MS/MS)测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法。

技术介绍

[0002]阿仑膦酸钠(Alendronate sodium)，化学名为4
‑
氨基
‑1‑
羟基亚丁基双磷酸钠，结构式如下所示，是第三代骨吸收抑制剂，与骨内羟基磷灰石有强亲和力，能抑制破骨细胞活性，并通过成骨细胞间接起抑制骨吸收作用。阿仑膦酸钠的特点是抗骨吸收性强，无矿化抑制作用，避免了前两代药物的许多缺陷和不足，对骨吸收的抑制作用是第一代产品依替膦酸盐的1000倍，是第二代产品帕米膦酸盐的10倍，在国际上被认为是二十一世纪最具潜力的骨质疏松症药物，1995年被美国FDA推荐为骨质疏松症的治疗用药。
[0003][0004]众所周知，阿仑膦酸钠的自身结构特点决定了其含量测定成为技术难题：阿仑膦酸钠是一种强极性离子化合物，不能在反相色谱柱上保留；其结构中无生色团，不能直接用紫外检测器和荧光检测器检测；存在多级电离状态，干扰质谱检测。受限于阿仑膦酸钠自身结构特点，现有技术多采用离子色谱法或离子对色谱法检测药品中的阿仑膦酸，例如中国药典2020版采用离子色谱法进行阿仑膦酸钠片中的含量测定。
[0005]相比于药品中阿仑膦酸含量的测定，生物样品中阿仑膦酸含量的测定具有更高的要求，须额外关注以下两方面的影响：
①
由于阿仑膦酸与生物样品中很多内源性物质的结构相似，所以必须采用合适的分离纯化步骤进行前处理，以排除其他内源性物质对后续检测的干扰；
②
根据阿仑膦酸钠片说明书记载，阿仑膦酸钠的口服生物利用度极低(≈0.6％)，且快速分布后主要通过尿排泄，导致生物样品尤其血浆中的阿仑膦酸钠浓度过低(<5ng/ml)，须选择高灵敏度的检测方法才能检出。
[0006]显然，前述的离子色谱法无法满足生物样品检测的分离纯化和灵敏度的要求，不利于检测。为提高阿仑膦酸在生物样品中浓度检测的选择性和灵敏度，需将生物样品中的阿仑膦酸衍生化处理以克服其结构缺点，使之能够应用于更高灵敏度的检测方法。
[0007]检索分析现有技术后发现，阿仑膦酸的衍生化处理大致可分为两个方向：
①
引入生色团，例如文献1等通过衍生化引入氯甲酸
‑9‑
芴甲酯，并采用荧光检测的HPLC法，检测灵敏度为3.5ng/ml；
②
甲基衍生化，例如文献2和中国专利CN111948307A等通过重氮甲烷(DAM)衍生化，并采用LC
‑
MS/MS检测，文献2的检测灵敏度为50pg/ml。相比之下，前者灵敏度较低，一般用于尿样中阿仑膦酸的检测，而后者灵敏度更高，可用于血样中阿仑膦酸的检
测。
[0008]但是，文献2和中国专利CN111948307A采用的衍生化试剂DAM性质不稳定且易爆炸，不具有普适性；而，三甲基硅烷化重氮甲烷(TMS
‑
DAM)作为比DAM更安全的替代衍生化试剂可以考虑替换。例如，文献3公开了一种液相色谱串联质谱检测生物样品中阿仑膦酸的方法，先进行HLB、WAX两次固相萃取，再进行TMS
‑
DAM衍生化(即柱后衍生化)，然后以0.1％甲酸、0.1％甲酸乙腈为混合流动相，梯度洗脱，进行LC
‑
MS/MS检测，达到0.5mL血样中的定量下限(LLOQ)为100ng/ml。由此可见，TMS
‑
DAM虽能替代DAM，但技术不足之处在于会导致生物样品中阿仑膦酸的检测灵敏度显著降低，有待改善提高。
[0009]正如文献4第2940
‑
2941页所述，TMS
‑
DAM衍生化后LC
‑
MS/MS检测灵敏度降低的原因可能在于：TMS
‑
DAM衍生化反应速率慢，不适用于DAM的柱上衍生化法，而需要萃取后30min以上的反应时间(即柱后衍生化法)，反应式如下所示。
[0010][0011]综上所述，为了实验安全性，采用TMS
‑
DAM作为衍生化试剂，而TMS
‑
DAM衍生化反应完全只能采用柱后衍生化法，由此产生的LC
‑
MS/MS检测生物样品中阿仑膦酸的灵敏度降低这一技术问题该如何解决，是本领域尚未解决的技术难题。
[0012]【
技术介绍
涉及的相关文献出处如下】：
[0013]文献1：Ptacek P,et al.Determination of alendronate inhuman urine as 9
‑
fluorenylmethyl derivative by high
‑
performance liquid chromatography[J].J Chromatogr B,2002,767(1):111
–
116.
[0014]文献2：Lee S.Zhu et al.A general approach for the quantitative analysis of bisphosphonates in human serum and urine by high
‑
performance liquid chromatography_tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun.Mass Spectrom.2006,20:3421
–
3426.
[0015]文献3：April S.Y.Wong et al.Liquid chromatography
–
mass spectrometry analysis of five bisphosphonates in equine urine and plasma[J].Journal of Chromatography B,998
‑
999,2015,1
–
7.文献4：Veniamin N Lapko et al.Quantitative analysis of bisphosphonates in biological samples[J].Bioanalysis,2014,6(21):2931
–
2950.)

技术实现思路

[0016]本专利技术要解决的技术问题在于：在采用固相萃取、TMS
‑
DAM柱后衍生化、LC
‑
MS/MS检测的前提下，专利技术人团队通过进一步优化固相萃取填充材料的种类(三甲基氨丙基官能化亲水苯乙烯
‑
二乙烯基苯)、洗脱溶剂的种类(盐酸甲醇溶液)，和/或进一步优化LC
‑
MS/MS检测条件中的流动相种类(0.5％甲酸溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LC
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MS/MS测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法，包括如下步骤：步骤1：生物样品的纯化将待测的生物样品与内标工作液混合，加水稀释；稀释后的样品进行固相萃取，用有机溶剂洗脱，挥干；步骤2：生物样品的衍生化对步骤1所得的生物样品复溶，加入三甲基硅烷化重氮甲烷进行衍生化反应，反应结束后挥干；步骤3：液相色谱串联质谱检测将步骤2所得的生物样品复溶，离心，取上清液进样于液相色谱
‑
串联质谱联用仪，进行LC
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MS/MS分析，测定生物样品中阿仑膦酸浓度。2.如权利要求1所述的LC
‑
MS/MS测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤1中的固相萃取采用填充材料为三甲基氨丙基官能化亲水苯乙烯
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二乙烯基苯的PAX固相萃取板或PAX固相萃取柱。3.如权利要求1所述的LC
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MS/MS测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤1中的洗脱溶剂为盐酸甲醇溶液；优选的，盐酸浓度为0.02M～0.4M；更优选的，盐酸浓度为0.1M。4.如权利要求1所述的LC
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MS/MS测定生物样品中阿仑膦酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤1包括：取200μL生物样品与20.00μL内标工作液混合，加入超纯水稀释后，加入经甲醇、超纯水活化平衡的PAX 96孔固相萃取板中，依次加入超纯水、甲醇淋洗后干燥，加入盐酸甲醇溶液进行洗脱，洗脱液挥干。5.如权利要求1所述的LC
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MS/...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振华，余裕春，周杨，曲双，乐艳，徐梦露，楼金芳，
申请(专利权)人：杭州百杏生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：