选择性改变微生物群用于免疫调节制造技术

本发明专利技术涉及选择性改变微生物群用于免疫调节。本发明专利技术涉及通过改变患者的微生物群来调节患者中的免疫细胞的方法。本发明专利技术还涉及通过改变受试者的微生物群来调节受试者生物体中的治疗或疗法的方法。本发明专利技术还涉及用于实现这一点的细胞群体、系统、阵列、细胞、RNA、试剂盒和其他工具。在一个实例中，有利地使用引导的核酸修饰进行人肠道微生物群中的特定物种的选择性靶向以实现所述改变。选择性靶向以实现所述改变。

【技术实现步骤摘要】
选择性改变微生物群用于免疫调节


[0001]本专利技术涉及通过改变患者的微生物群来调节患者中的免疫细胞(患者的内源性细胞和/或施用的细胞，如经由过继性细胞疗法)的方法。本专利技术还涉及通过改变受试者的微生物群来调节受试者生物体中的治疗或疗法的方法。本专利技术还涉及用于实现这一点的细胞群体、系统、试剂盒和其他工具。在一个实例中，有利地使用引导的核酸修饰进行人肠道微生物群中的特定物种的选择性靶向以实现改变。

技术介绍

[0002]一种免疫治疗方法涉及工程改造患者自身(或供体)的免疫细胞以表达识别和攻击肿瘤的细胞表面抗原受体(CAR)。尽管此方法(称为过继性细胞转移(ACT))迄今为止仅限于小型临床试验，但使用这些工程改造的免疫细胞的治疗已经在患有晚期癌症的患者中产生一些显著的响应。
[0003]嵌合抗原受体(CAR)由与T细胞信号传导结构域融合的源自抗体的靶向结构域组成，当由T细胞表达时其赋予T细胞以由CAR的靶向结构域所决定的抗原特异性。CAR可以潜在地将T细胞的效应功能重定向于细胞表面上表达的任何蛋白和非蛋白靶标，只要基于抗体的靶向结构域可用。此策略由此避免了靶细胞对抗原的加工和呈递的需要并且适用于非典型的T细胞靶标，如碳水化合物。HLA限制的这种规避意味着CAR T细胞方法可用作拓宽过继性T细胞疗法的应用潜力的一般工具。参见，例如Methods Mol Biol.2012；907:645
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66.doi:10.1007/978
‑1‑
61779
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974
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7_36,“Chimeric antigenreceptors forT
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cellbasedtherapy”,Cheadle EJ等人。
[0004]第一个CAR
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T构建体由免疫疗法先驱Zelig Eshhar于1989年在PNAS的论文中描述。CAR的结构现在包含跨膜多肽链，其为来自不同细胞蛋白的不同结构域的嵌合体。例如，CAR具有(经常通过接头和/或绞链区)连接至胞内部分的胞外部分，其中CAR的跨膜部分使受体嵌入免疫细胞(通常是T细胞)的膜中。胞外部分包括抗体结合位点(通常以scFv的形式，如来源于小鼠mAb)，其识别靶抗原，所述靶抗原通常是在癌细胞表面上的肿瘤相关抗原(TAA)。抗原识别以此方式省去了对TCR的依赖的需要，TCR需要MHC限制的抗原呈递，且其中结合亲和力可相对较低。CAR的胞内部分通常包括用于当抗原结合至胞外结合位点时进行胞内信号传导的CD3
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zeta(CD3ζ)结构域。新一代CAR还包括增强T细胞介导的应答的其他结构域，其通常为4
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1BB(CD137)或CD28胞内结构域。一旦遇到CAR结合位点的同源抗原配体，CAR便可活化胞内信号传导及由此CAR T细胞的活化以增强肿瘤细胞杀伤。
[0005]大多数CAR
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T在体内扩增，因此常规意义上的剂量滴定是困难的，且在很多情况下，工程改造的T细胞似乎“永远”有活性，即，迄今为止见于大部分CD19 CAR
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T临床研究中的持续的B细胞发育不全的观察结果。这对CAR T细胞方法提出了一个严重的问题。一些观察到的风险论述于Discov Med.2014Nov；18(100):265
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71,“Challenges to chimeric antigen receptor(CAR)
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T cell therapy for cancer”,Magee MS&SnookAE中，该文献说明了在结肠直肠癌症转移至肺和肝的患者中出现的CAR
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T细胞治疗之后的首个严重不良事
件(Morgan等人,2010)。此患者是用表达靶向表皮生长因子受体2(ERBB2、HER2)的第三代CAR的T细胞进行治疗。CAR含有来源于4D5抗体(曲妥珠单抗)的scFv，曲妥珠单抗被FDA批准用于治疗HER2阳性乳腺癌(Zhao等人,2009)。患者在接受单剂量的10
10
个CAR
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T细胞的15分钟内发生呼吸窘迫，然后在5天过程期间有多次心跳停止，最终导致死亡。治疗之后四小时的血清分析揭示细胞因子IFNγ、GM
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CSF、TNFα、IL
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6和IL
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10有明显增加。CAR
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T细胞见于肺及腹部和纵隔淋巴结中，而未见于肿瘤转移中。研究者将毒性归结于在肺上皮中的HER2识别，由此造成产生肺毒性的炎性细胞因子的释放和细胞因子释放综合征(CRS)，从而导致多器官衰竭(Morgan等人,2010)。目前，其他研究者正在将遵循保守剂量递增策略并利用来源于不同抗体(FRP5)的第二代靶向HER2的CAR的试验用于多种HER2+恶性肿瘤(clinicaltrials.gov标识号NCT01109095、NCT00889954和NCT00902044)。
[0006]针对CAR T细胞主题的变化是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)治疗剂，其使用CD16A(FCγRIIIA)来结合至肿瘤特异性IgG的Fc区(参见，例如WO2015/058018、US2015139943)。该目标是通过滴定向患者施用的IgG在体内实现对CAR T细胞活性的更多控制。然而，CAR
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T细胞的CD16结合位点可为游离的，还结合至患者的内源性IgG并且这降低了该方法的吸引力。该方法还需要考虑IgG在身体内固有的长半衰期(对于人中的IgG为约20天)，这可能限制了对CAR
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细胞活性的控制。正在进行的研究可对此风险进行评估。
[0007]期望提供调节(下调或上调)基于免疫细胞的疗法、如CAR
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T
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细胞方法和其他基于细胞的方法的替代方式。还期望提供一种方式来解决由内源性免疫细胞介导的疾病和病况，如自身免疫、炎性和感染性疾病和病况。

技术实现思路

本专利技术提供了如本文权利要求中所阐述的引导的核酸酶、修饰宿主细胞的(HM)
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CRISPR/Cas系统、gRNA、HM
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阵列、HM
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crRNA、HM
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Cas、HM
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TALEN、HM
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大范围核酸酶、HM
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锌指和方法。
[0009]医疗实践经常涉及向患者施用抗生素。此类治疗通常可以涉及施用广谱抗生素，或没有区别地靶向许多革兰氏阳性细菌物种或许多革兰氏阴性物种的抗生素。类似地，例如，在耕作和农业中使用广谱抗生素引起环境问题，包括此类抗生素进入人和动物食物链中，这可能对健康有害并且可能增加微生物抗性的发展。相反，本专利技术涉及选择性靶向第一微生物群物种或菌株。如本文的工作实施例中所示，已使用靶向所选物种的基因组的引导的核酸酶实现了对特定细菌物种的选择性靶向本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于治疗或减少患者中的疾病或病况的方法中的引导核酸酶系统，其中所述方法包括通过使用所述系统的引导核酸酶改变所述患者的微生物群来调节所述患者中的免疫细胞，其中所述疾病或病况由免疫细胞(例如，T细胞)介导或通过改变所述患者中的免疫细胞活性或群体来治疗或预防。2.权利要求1的系统，其中所述方法包括使用所述引导核酸酶选择性靶向所述微生物群中第一物种的细胞的基因组以实现所述改变。3.权利要求2的系统，其中所述选择性靶向避免靶向(i)与所述第一物种相同的门的物种，或(ii)第一物种的不同菌株。4.任一前述权利要求的系统，其中所述方法选择性杀死所述微生物群中的第一细胞，而不靶向第二细胞，其中所述第二细胞是(i)第一物种的菌株的相关菌株的细胞或(ii)与第一物种不同并且与第一物种系统发生相关的物种的细胞，其中所述第二物种或菌株具有编码16s核糖体RNA的DNA序列，其与所述第一细胞物种或菌株的编码16s核糖体RNA的DNA序列具有至少80％同一性，其中所述方法不抑制所述微生物群中第二细胞的生长，或所述第一细胞的生长抑制是所述第二细胞的生长抑制的至少5倍。5.任一前述权利要求的系统，其中：(a)所述患者是人患者；(b)所述微生物群是肠道微生物群；(c)所述方法包括使用所述引导核酸酶选择性靶向所述微生物群中第一物种的基因组以实现所述改变；且(d)其中所述方法选择性杀死所述微生物群中的第一细胞，而不靶向第二细胞，其中所述第二细胞是(a)第一物种的菌株的相关菌株的细胞或(b)与第一物种不同并且与第一物种系统发生相关的物种的细胞，其中所述第二物种或菌株具有编码16s核糖体RNA的DNA序列，其与第一细胞物种或菌株的编码16s核糖体RNA的DNA序列具有至少80％同一性。6.免疫细胞的离体群体，其用于治疗或预防患者中的疾病或病况的患者的过继性细胞疗法的方法中，所述方法包括：(a)在所述患者中进行过继性免疫细胞疗法，包括向所述患者施用所述群体的细胞，其中所述免疫细胞的施用能够治疗所述患者中的疾病或病况；和(b)改变所述患者的肠道微生物群中的第一细菌物种或菌株或古细菌物种或菌株的细胞亚群的相对比例，由此产生调节所述患者中的免疫细胞疗法的改变的肠道微生物群；其中步骤(b)通过与所述免疫细胞群体同时或依次向其施用抗细菌或抗古细菌的引导核酸酶系统来靶向第一细胞的亚群来进行，由此杀死第一细胞或减少所述亚群生长，由此减少所述亚群在所述患者的肠道微生物群中的比例。7.权利要求2至6中任一项的系统或群体，其中所述第一细胞是细菌或古细菌细胞，例如厚壁菌门细胞。8.权利要求2至7中任一项的系统或群体，其中所述方法包括修饰(例如，切割和/或突变)所述第一物种的细胞的一种或多种靶基因组或附加体核苷酸序列。9.权利要求2至8中任一项的系统或群体，其中所述第一细胞包含宿主细胞群体，所述方法包括修饰所述宿主细胞中的靶序列，其中所述靶序列修饰通过如下进行：a.将微生物群与编码宿主修饰(HM)crRNA的工程改造的核酸序列的多个拷贝组合，和
b.在宿主细胞中表达HM
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crRNA，其中每个工程改造的核酸序列可在相应宿主细胞中用Cas核酸酶操作以形成HM
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CRlSPR/Cas系统，并且所述工程改造的序列包含：(i)间隔区和编码HM
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crRNA的重复序列；(ii)HM
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crRNA，其包含能够与宿主细胞靶序列杂交以将Cas核酸酶引导至宿主细胞中的靶序列的序列；和任选地，所述HM
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系统包含tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；由此HM
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crRNA引导宿主细胞中宿主靶序列的Cas修饰，由此杀死宿主细胞或减少宿主细胞群体生长，由此减少所述第一细胞在微生物群中的比例。...

【专利技术属性】
技术研发人员：J克卢贝，M索默，C格隆达尔，R瓦兹克茨尤里贝，E范德黑尔姆，
申请(专利权)人：斯尼普技术有限公司，
类型：发明
国别省市：