乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂及制备方法和应用。所述乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂为由抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上制备而成；所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体为通过将抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区序列优化后，制备重组载体，再在大肠杆菌中表达而获得。该乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂在保证对血浆中HBsAg清除效率的同时，极大地降低了配基的生产成本，明显提高了该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂在乙型肝炎病毒净化吸附领域转化的可能性，具有极大的应用潜力和商业价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及免疫吸附剂材料制备
，尤其涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致肝炎、肝硬化、肝癌等的重要致病因素。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)大量存在于乙肝病毒感染者的血液中，是HBV感染的标志物之一。针对目前乙型肝炎无法完全治愈的现状，全球针对乙肝的治疗暂且只能追求功能性治愈，即有效降低HBsAg水平，恢复机体免疫系统功能，让患者不需要长期服用药物，就能够依靠人体自身免疫系统抑制HBV。
[0003]本申请人一直致力于乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂的研发。吸附剂由载体和配基通过化学偶联连接在一起，利用配基与HBsAg具备抗原抗体特异性结合的原理，通过吸附剂的方式清除乙肝病人血液中大量存在的HBsAg。单克隆抗体具有较高的特异性和亲和力，使其成为乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂优良的配基。
[0004]但是，现有技术中，单克隆抗体须由真核表达系统生成，且宿主细胞的培养需要较高的环境要求，导致单克隆抗体的生产成本居高不下，因而成为乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂乃至吸附柱市场化的瓶颈。
[0005]羊驼血清中存在着一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体。单域重链抗体是指仅由重链抗体可变区组成的基因工程抗体，又称为VHH抗体或纳米抗体。与传统抗体相比较，单域重链抗体可由原核表达系统制备，从而大大简化了培养工艺并降低了生产成本，是一种优良的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂的配基。
[0006]有鉴于此，有必要设计一种改进的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂及制备方法和应用，以解决上述问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂及制备方法和应用。
[0008]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其为由抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上制备而成；
[0009]所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体为通过将抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区氨基酸序列定点突变，将突变后的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子序列优化，再将序列构建重组表达载体，最终在大肠杆菌中表达而获得；
[0010]所述乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂对HBsAg阳性血浆中的HBsAg吸附效率达到90％以上。
[0011]作为本专利技术的进一步改进，所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体的氨基
酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012]作为本专利技术的进一步改进，所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体的氨基酸序列并不限于SEQ ID NO.1所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.1所示的序列上经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除得到的，且具有与SEQ ID NO.1相同生物活性，例如与乙肝表面抗原特异性结合的活性或者是活性加强或者活性减弱的衍生序列；这类衍生序列也属于本专利技术的保护范围。
[0013]所述抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0014]作为本专利技术的进一步改进，所述大肠杆菌密码子序列优化的过程中，大肠杆菌优化密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用于编码所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，采用带GST标签的pGEX
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6P
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1载体进行载体构建，得到所述重组载体后，再进行大肠杆菌表达。
[0016]作为本专利技术的进一步改进，所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体与所述吸附剂载体的比例为(0.1
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20)mg：1g。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，所述吸附剂载体为琼脂糖、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇中的一种或几种组合。
[0018]为实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了一种上述乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂的制备方法，包括如下步骤：
[0019]S1，序列优化：以抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.3为基材，将抗HBsAg人源化单克隆抗体VH在FR2区域的37V
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44G
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45L
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47W突变为驼科VHH偏好性的37Y
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44E
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45R
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47G，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；然后，进行大肠杆菌密码子序列优化，得到大肠杆菌优化密码子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并进行合成，得到合成基因；；
[0020]S2，载体构建：以合成基因序列为模板，进行目的片段的扩增，得到VHH基因；然后，采用带GST标签的pGEX
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6P
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1载体，依次进行载体双酶切处理、VHH基因与双酶切处理载体进行同源重组、重组产物的转化和阳性克隆的鉴定，得到重组表达载体；
[0021]S3，单域抗体制备：将重组表达载体转化大肠杆菌表达菌株中诱导表达，再进行蛋白纯化，得到纳米抗体，即为抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体；
[0022]S4，按(0.1
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20)mg：1g的比例，将所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体作为配基和吸附剂载体通过化学方法共价偶联，制备得到乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂。
[0023]为实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了上述乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂在乙型肝炎病毒净化吸附领域的应用。
[0024]为实现上述专利技术目的，本专利技术还提供了一种抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其制备方法包括如下步骤：
[0025]S1，序列优化：以抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.3为基材，将抗HBsAg人源化单克隆抗体VH在FR2区域的37V
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44G
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45L
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47W突变为驼科VHH特有的37Y
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44E
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45R
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47G，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；然后，进行大肠杆菌密码子序列优化，得到大肠杆菌优化密码子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并进行合成，得到合成
基因；
[0026]S2，载体构建：以合成基因序列为模板，进行目的片段的扩增，得到VHH基因；然后，采用GST标签的pGEX
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6P
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1载体，依次进行载体双酶切处理、VHH基因与双酶切处理载体进行同源重组、重组产物的转化和阳性克隆的鉴定，得到重组表达载体；
[0027]S3，单域抗体制备：将重组表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其特征在于：所述乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂为由抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上制备而成；所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体为通过将抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区氨基酸序列定点突变，将突变后的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，再将序列构建重组表达载体，最终在大肠杆菌中表达而获得；所述乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂对HBsAg阳性血浆中HBsAg的吸附效率达到90％以上。2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其特征在于：所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其特征在于：所述大肠杆菌密码子序列优化的过程中，大肠杆菌优化密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用于编码所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体。4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其特征在于：采用带GST标签的pGEX
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6P
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1载体进行重组表达载体构建，得到所述重组载体后，再进行大肠杆菌表达。5.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其特征在于：所述抗HBsAg单克隆抗体重链可变区单域抗体与所述吸附剂载体的比例为(0.1
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20)mg：1g。6.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂，其特征在于：所述吸附剂载体为琼脂糖、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇中的一种或几种组合。7.一种权利要求1
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6任一项权利要求所述的乙型肝炎病毒表面抗原纳米抗体吸附剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1，序列优化：以抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.3为基材，将抗HBsAg人源化单克隆抗体VH在FR2区域的37V
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47W突变为驼科VHH偏好性的37Y
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44E
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45R
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47G，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；然后，进行大肠杆菌密码子序列优化，得到大肠杆菌优化密码子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并进行合成，得到合成基因；S2，载体构建：以合成基因序列为模板，进行目的片段的扩增，得到V...

【专利技术属性】
技术研发人员：高双双，王业富，
申请(专利权)人：武汉瑞法医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：