一种星形胶质细胞的制备方法技术

本申请提供一种制备星形胶质细胞的方法，包括在化学成分确定的培养基中贴壁培养神经干细胞或神经前体细胞。本发明专利技术还涉及通过所述方法制备的功能性星形胶质细胞及其用途。特别地，本发明专利技术的星形胶质细胞制备方法可适配用于制备适合于临床应用的星形胶质细胞。制备适合于临床应用的星形胶质细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种星形胶质细胞的制备方法


[0001]本申请涉及细胞培养方法，具体而言涉及使用神经干细胞和/或神经前体细胞制备具有期望的功能的星形胶质细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]星形胶质细胞作为组成神经组织的大量胶质细胞之一，在维持适合神经元的细胞外环境中发挥至关重要的作用。星形胶质细胞不传导电冲动，一直被视为支持细胞。与神经元相比，星形胶质细胞和其他神经胶质细胞在很大程度上尚未得到充分研究。
[0003]现已知晓星形胶质细胞的功能改变在肌萎缩侧索硬化症(ALS)和其他神经退行性疾病中发挥关键作用。还有报道显示星形胶质细胞负责控制神经元连接的强度，通过吞噬旧的突触的“突触修剪”机制来介导突触的消除，从而在突触重塑过程中担任重要角色(Won
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Suk Chung,et al.2013,Nature.Dec 19；504(7480):394
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400)。因此，认为星形胶质细胞能够用于治疗神经退行性病变和中枢神经系统损伤，在脑损伤的修复方面发挥作用并用于治疗目的(Barbeito L.Stem Cell Res Ther.2018；9(1):241；Weber RZ,et al.,Brain Pathol.2021；31(5):e12999)。人类的星形胶质细胞体积大、结构复杂，传播钙波的速度高于啮齿类动物的星形胶质细胞，适合于人脑的损伤修复。
[0004]作为生成星形胶质细胞的方法，经典的分化方法是通过将神经球(neurosphere)悬浮培养至180天后，自然分化获得纯度较高的星形胶质细胞(Krencik R,et al.,Nat Biotechnol.2011；29(6):528
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534)。这样的方法得到的细胞功能性和成熟度较高，但受限于产量低、周期长。
[0005]后来，开发了一种用时更短的方法。该方法使用贴壁神经前体细胞(NPC)培养至28
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90天，并添加1
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10％胎牛血清(FBS)来扩增星形胶质细胞的方法(Tcw J et al.,Stem Cell Reports.2017；9(2):600
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614)。这样的方法获得的细胞纯度较低，需要进行分选纯化，且需要使用FBS。鉴于FBS是血清而非化学成分确定的试剂，FBS的使用会造成产品批次差异，引入动物源成分污染，因此期望在获得星形胶质细胞的过程中尽量不使用FBS。
[0006]近期的方法主要是通过病毒感染或基因编辑的手段，使细胞高表达与星形胶质细胞发育相关的基因，从而促进分化(Canals I et al.,Nat Methods.2018Sep；15(9):693
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696.)。这样的方法大约在21
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60天后可分化得到纯度较高的成熟星形胶质细胞。但由于需要对细胞进行基因改造，存在潜在的安全隐患。
[0007]当前基于人诱导多能干细胞(hiPSC)的星形胶质细胞分化方法通常依赖于神经前体细胞(NPC)或少突胶质祖细胞中间体。虽然已经广泛证明hiPSCs可以分化为功能性星形胶质细胞，以用于体外神经精神疾病的基于细胞的模型或体内植入治疗神经系统疾病等用途，但现有方法较慢长(长达6个月)或需要分选以提高纯度。
[0008]另外，从将细胞用于临床治疗的角度出发，上述方法均难以简单地转化为符合临床级使用的生产方法。为了符合临床级的使用，不能使用含有动物成分的制剂，也应该尽量避免引入安全性不明的遗传修饰等手段。
[0009]因此，本领域仍然需要一种耗时相对较短且重复性好的人星形胶质细胞制备方法，并且由此制备的星形胶质细胞能够适合临床应用。因此，为了短期内、大批量生产治疗用星形胶质细胞，以及对星形胶质细胞的功能进行研究，需要制备人星形胶质细胞的新方法。

技术实现思路

[0010]专利技术人开发了一种贴壁培养的方法，其使用具有星形胶质细胞分化潜能的细胞作为起始细胞材料，通过简单的操作，在相对较短的时间内获得了具有预期功能的星形胶质细胞群体，由此完成了本专利技术。
[0011]本专利技术的方法简单易行，可以利用多种细胞类型作为起始细胞，包括神经干细胞、神经前体细胞或经历了一定分化的神经干细胞、神经前体细胞的培养物。本专利技术的方法中不涉及基因编辑，并且不使用动物来源的试剂例如血清，因此具有较高的安全性。在此基础上，还可以通过将方法中使用的培养基和试剂替换为符合临床级用品生产标准的对应物质，使方法以及方法获得的产品能够符合临床使用的标准和规范。
[0012]因此，第一方面，本申请提供一种制备星形胶质细胞的方法，包括从具有星形胶质细胞分化潜能的细胞群体(例如，神经干细胞(NSC)、神经前体细胞(NPC)、NSC
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或NPC
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衍生的细胞产物)获得有功能的星形胶质细胞的快速便捷的方法，包括对所述细胞群体进行贴壁培养。所述方法获得的星形胶质细胞中GFAP阳性细胞的比例不低于60％。在优选的方案中，所述方法获得的星形胶质细胞是适合于临床应用的星形胶质细胞。
[0013]第二方面，本申请提供通过第一方面的方法获得的星形胶质细胞或含有星形胶质细胞的细胞群体。
[0014]第三方面，本申请提供通过包含第二方面的星形胶质细胞或细胞群体，其中进一步包含星形胶质前体细胞，所述星形胶质前体细胞为S100β阳性。
[0015]第四方面，本申请提供第二方面的星形胶质细胞或第三方面的细胞群体用于制备药物的用途。例如，所述药物用于治疗与中枢神经系统(CNS)相关的疾病。例如，所述药物用于治疗神经退行性疾病。
[0016]第五方面，本申请提供制备神经元的方法，包括将第二方面的星形胶质细胞或细胞群体与具有分化成神经元的潜能的细胞，如神经干细胞或神经前体细胞一起共培养。
[0017]第六方面，本专利技术涉及用于第一方面的方法的试剂和培养基组合，或包含它们的试剂盒。
[0018]本申请的方法通过使用不同脑区来源的星形胶质细胞分化潜能细胞群体，可以获得分化为不同脑区属性的星形胶质细胞，这些细胞均包含在本申请的范围内。
[0019]本申请的优点至少在于如下方面。
[0020]本申请用于分化细胞的方法简单，无需进行分选性纯化。
[0021]本申请的方法不包括对细胞进行遗传改造，不涉及利用病毒等载体向细胞导入基因，不需要人工增加特定基因的表达或特定因子的分泌，又或使细胞表面表达用于分选的标签或表达物。由此本专利技术的方法节省了成本，缩短了获得细胞所需的时间。更为重要的是，由于不涉及外源基因的引入，增加了将本专利技术的方法获得的细胞用于细胞疗法时的安全性。
[0022]通过本专利技术的方法获得的星形胶质细胞具有期望的功能，因而能够在体外执行星形胶质细胞重要功能，包括神经元支持、谷氨酸摄取和吞噬作用。
[0023]本申请的方法产量高，获得的成熟星形胶质细胞具有高纯度和高成熟度。不仅适合研究用途，也能够用于临床用途。
[0024]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备星形胶质细胞的方法，所述方法包括如下步骤：(1)提供神经干细胞或神经前体细胞，并将其作为所述方法中的第0代细胞(P0)；(2)将所述神经干细胞或神经前体细胞接种到用细胞粘附介质包被的培养容器的平面上，或将所述神经干细胞或神经前体细胞与细胞粘附介质一起接种到培养容器中，其中接种后的所述神经干细胞或神经前体细胞为第1代细胞(P1)；(3)在适合所述神经干细胞或所述神经前体细胞分化为星形胶质前体细胞的条件下对所述神经干细胞或神经前体细胞(P1)进行贴壁培养，以获得星形胶质前体细胞；(4)将步骤(3)获得的星形胶质前体细胞接种到用细胞粘附介质包被的培养容器的表面上，或将所述星形胶质前体细胞与细胞粘附介质一起接种到培养容器中；和(5)在适合所述星形胶质前体细胞分化为星形胶质细胞的条件下对所述星形胶质前体细胞进行贴壁培养，以获得星形胶质细胞。2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)包括对神经干细胞或神经前体细胞进行培养。3.权利要求2所述的方法，其中所述培养通过如下方式之一进行：(a)在神经干细胞培养基中培养；(b)在神经前体细胞培养基中培养；或(c)在分化培养基中培养。4.权利要求3所述的方法，将所述培养持续到有星形胶质细胞样细胞出现。5.权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中步骤(2)或步骤(4)中的细胞粘附介质为基质胶。6.权利要求5所述的方法，其中所述基质胶选自下组：Matrigel、玻连蛋白(Vitronectin)或层粘连蛋白(Laminin)，优选层粘连蛋白。7.权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述基质胶浓度为5μg/mL～10μg/mL，优选6μg/mL～8μg/mL。8.权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中在步骤(3)的贴壁培养过程中，将所述细胞每5
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7天传代一次(优选在汇合度...

【专利技术属性】
技术研发人员：范靖，王安欣，章薇垚，
申请(专利权)人：浙江霍德生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：