一种代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过模块区室化、融合基因表达、下调分支代谢途径、提高电子供体等代谢改造策略，采用热带假丝酵母1C2P

【技术实现步骤摘要】
一种代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸的方法，属于生物


技术介绍

[0002]鼠尾草酸(carnosic acid,CA)是一种天然的酚类二萜类化合物，目前已知的鼠尾草酸的生物和药理活性就有多种：(1)抗氧化剂和风味调味剂：在食品和动物饲料中使用、作为延缓衰老的保健品添加剂；(2)抗菌：对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和汉逊酵母有不同程度的抑制作用，可用于食品防腐剂；(3)抗肿瘤：鼠尾草酸可以抑制肿瘤细胞的增殖，有望成为治疗血液系统恶性肿瘤的新药，用于治疗心血管疾病和癌症；(4)作为预防剂和治疗神经退行性疾病的药物，比如阿尔兹海默症；(5)作为保健品，具有减肥降脂功效作用。这使其在医药卫生、食品工业等行业中具有广泛的应用价值，其需求量也是逐年提高，因此，大规模生产鼠尾草酸成为必然的一种趋势。
[0003]目前我国对鼠尾草酸的生产仍然处于天然提取和化学合成阶段。天然提取主要是从迷迭香和鼠尾草等唇科类植物中提取，其优点是廉价且丰富的原始材料，但缺点是迷迭香和鼠尾草等植物生长环境受限、生长周期较长、环境污染严重等问题。而化学合成法所使用的原料和催化剂较为昂贵，具有成本高、安全性低、高污染性等缺点，不适合应用于食品及药品的添加。在现有报道当中，虽然已有安全高效的生物法合成鼠尾草酸的报道，例如：《Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform》报道了通过在酿酒酵母表达来源于迷迭香和鼠尾草的铁锈醇合酶以及鼠尾草酸合酶生产鼠尾草酸，发掘了下游鼠尾草酸合成途径的外源酶基因，但未经过代谢改造其底盘菌株并没有完全发挥生产鼠尾草酸的潜力。
[0004]因此，目前研究人员致力于通过代谢工程和合成生物学改造底盘细胞以安全高效、成本低廉的生物法合成鼠尾草酸的方法。

技术实现思路

[0005]在现有技术的基础上，本专利技术提供了代谢工程改造热带假丝酵母生物合成鼠尾草酸的方法。利用代谢工程和合成生物学技术，构建了一株高产鼠尾草酸的工程菌株的方法。本专利技术工程改造的重组热带假丝酵母菌株体具有较高的转化效率和产量，其以廉价底物葡萄糖为碳源高效生产鼠尾草酸。
[0006]本专利技术提供了一种高产鼠尾草酸的热带假丝酵母菌株，在热带假丝酵母1C2P
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PM04中整合表达SEQ ID NO.1所示的铁锈醇合酶CYP76AH24、SEQ ID NO.3所示的细胞色素还原酶ATR1和SEQ ID NO.5所示的鼠尾草酸合酶CYP76AK6，并下调表达SEQ ID NO.7所示的角鲨烯合酶ERG9。
[0007]在一种实施方式中，所述整合表达的位点为木糖还原酶位点；所述CYP76AH24和ATR 1之间以SEQ ID NO.9所示氨基酸序列连接。
[0008]在一种实施方式中，在宿主细胞的DPP3位点整合表达双拷贝的ATR1。
[0009]在一种实施方式中，编码所述铁锈醇合酶CYP76AH24的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述鼠尾草酸合酶CYP76AK6的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述细胞色素还原酶ATR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述角鲨烯合酶ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0010]在一种实施方式中，所述重组热带假丝酵母的宿主细胞为热带假丝酵母1C2P
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PM04。
[0011]本专利技术还提供了一种制备鼠尾草酸的方法，将所述重组热带假丝酵母在培养基中于29.5～30.5℃发酵。
[0012]在一种实施方式中，所述发酵的转速为199～201r/min。
[0013]在一种实施方式中，所述培养基包含酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
[0014]在一种实施方式中，至少发酵96h。
[0015]本专利技术还提供了所述重组热带假丝酵母在制备鼠尾草酸或含有鼠尾草酸的产品中的应用。
[0016]有益效果
[0017]本专利技术以热带假丝酵母1C2P
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PM04作为宿主菌株，通过模块区室化、融合基因表达、下调分支代谢途径、提高电子供体等代谢改造策略构建重组热带假丝酵母HD09，摇瓶发酵96h生产鼠尾草酸产量可达78.24mg/L。
附图说明
[0018]图1：本专利技术所构建的重组菌株M04
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CS、M04
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CD、M04
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PS和M04
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PD在YPD60发酵培养基中发酵4d的鼠尾草酸产量。
[0019]图2：本专利技术所构建的重组菌株M04
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CD、GE0、GEA、GEB、GEC、GED、GEE和GEF在YPD60发酵培养基中发酵4d的鼠尾草酸产量。
[0020]图3：本专利技术所构建的重组菌株M04
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CD、HD01、HD02、HD03、HD04、HD05和HD06在YPD60发酵培养基中发酵4d的鼠尾草酸产量。
[0021]图4：本专利技术所构建的重组菌株HD07、HD08和HD09在YPD60发酵培养基中发酵4d的鼠尾草酸产量。
具体实施方式
[0022]用于载体构建的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109；质粒Tm
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gda324
‑
URA3的构建方法公开于《热带假丝酵母遗传操作系统的建立及在二元酸合成中的应用》中。热带假丝酵母1C2P
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PM04和质粒Ts
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P
GAP1
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carRP
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T
ENO1
的具体构建方法公开于《热带假丝酵母生产萜类天然产物的系统代谢工程》中。质粒Ts
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CAT
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gda324
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URA3
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ptsgEiA
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P
GAP1
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dSpCas9
‑
T
ENO1
‑
CAT的构建方法公开于《Development of a gRNA Expression and Processing Platform for Effificient CRISPR
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Cas9
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Based Gene Editing and Gene Silencing in Candida tropicalis》。
[0023]下述实施例中所涉及的培养基如下：
[0024]LB培养基配方(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固体培养基另加1.5％
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2.0％
琼脂粉。
[0025]MM培养基配方(g/L)：葡萄糖20、酵母基础氮源培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组热带假丝酵母，其特征在于，在热带假丝酵母基因组上整合表达SEQ ID NO.1所示的铁锈醇合酶CYP76AH24、SEQ ID NO.3所示的细胞色素还原酶ATR1和SEQ ID NO.5所示的鼠尾草酸合酶CYP76AK6，并下调表达SEQ ID NO.7所示的角鲨烯合酶ERG9。2.如权利要求1所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，所述整合表达的位点为木糖还原酶位点；所述铁锈醇合酶CYP76AH24和细胞色素还原酶ATR1之间以SEQ ID NO.9所示氨基酸序列连接。3.如权利要求2所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，在宿主细胞的DPP3位点整合表达双拷贝的细胞色素还原酶ATR1基因。4.如权利要求3所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，编码所述铁锈醇合酶CYP76AH24的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述细胞色素还原酶ATR1的核苷酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈献忠，曹钰，杨海泉，霍达，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：