一种阳离子抗菌糖脂肽GLP6的制备及在细菌感染治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有良好生物相容性、稳定性以及抗菌活性的两亲性阳离子抗菌糖脂肽GLP6的制备及其在治疗细菌感染中的应用，属于医药领域。所述抗菌糖脂肽GLP6的序列为C8H

【技术实现步骤摘要】
一种阳离子抗菌糖脂肽GLP6的制备及在细菌感染治疗中的应用


[0001]本专利技术属于医药领域，具体涉及一种具有良好生物相容性、稳定性以及抗菌活性的两亲性阳离子型抗菌糖脂肽GLP6的制备及其在治疗细菌感染中的应用。

技术介绍

[0002]人类发现并应用抗生素，是人类医学上的一次伟大革命。但由于抗生素的滥用导致许多菌株的耐药性不断提高，产生了一系列的超级细菌。尤其是多药耐受型超级细菌的不断浮现，对人类的健康构成了严重威胁。因此迫切需要开发出规避这些耐药机制的可用于耐药菌株的新治疗剂。其中，抗菌肽(AMPs)作为一种可从自然来源中提取并用于对抗耐药菌的潜在候选物，引起了广泛关注。抗菌肽具有广谱抗菌活性，尤其是对某些耐药性病原菌具有杀灭作用。除此之外，抗菌肽还表现出促进机体组织愈合及调节体内免疫系统等活性。
[0003]研究表明，抗菌肽可以通过膜靶向机制发挥杀菌作用，即抗菌肽的阳离子残基最初通过静电相互作用接触带负电荷的细菌表面，同时疏水性结构域与磷脂的尾部通过疏水作用相互结合，使细菌膜形成较大孔洞，导致细菌死亡。另外，抗菌肽也可通过非膜靶向机制发挥作用。大多数细菌要分泌的蛋白质都是以带有氨基端信号肽延伸(Signal peptide，SP)的前蛋白形式合成，前蛋白一般通过分泌和双精氨酸易位途径进行跨膜运输，一旦被转运到膜上，膜结合型丝氨酸蛋白酶—I型信号肽酶(Type I signal peptidases，SPase I)就会切割SP，将SP从转位的前蛋白中分离出来，从而在膜上释放分泌的蛋白，并允许它们定位到周质、外膜或细菌外环境中。抑制SPase I活性会阻碍蛋白质分泌，干扰细菌的功能，最终导致细菌死亡。由于AXA基序是SPase I识别位点，拟将AXA基序设计到膜靶向抗菌肽骨架里以提高抗菌肽对病原菌的特异性结合能力(即靶向SPase I能力)，从而提高其抗菌活性，减少毒副作用。AXA基序位于肽链的左端氨基端，当AXA右侧的酰胺键被切割后，整个肽链可以分为两部分，剩余肽链可通过膜靶向作用继续发挥作用。
[0004]五肽基序(FLPII)是在具有优异抗微生物和免疫调节活性肽的N末端的保守序列。为了设计具有优异生物活性的合成肽，可以将基序FLPII设计到一些肽的N末端来降低溶血性，并通过增加白细胞向感染部位的迁移和抑制对清除感染至关重要的促炎因子而表现出免疫调节特性。其中的脯氨酸能够诱导形成弯曲结构，降低α
‑
螺旋肽的溶血性。最后，脂肪酸修饰能够增加两亲性多肽与细菌膜间的疏水性相互作用，可以提高抗菌肽的杀菌活性。糖基化可增加抗菌肽靶向性，提高其生物利用度和稳定性。其中，氨基葡萄糖(GlcN)能够在中等温度(25℃和37℃)下加速蛋白质糖基化，是肽糖基化的潜在候选者。因此对设计合成的具有两亲性α
‑
螺旋结构的阳离子直链抗菌肽骨架进行脂化和糖基化修饰。
[0005]已知抗菌肽的抗菌活性与它所具有的阳离子性和疏水性有着密切的关系。抗菌肽的正电荷是其结合细菌外膜层的基础。对于革兰氏阴性菌，阳离子型的抗菌肽易与其外膜上带负电荷的脂多糖相互作用，从而破坏外膜结构。所以增加抗菌肽的正电荷数量，可以增
强抗菌肽与膜的结合能力，进而有利于提高抗菌活性。抗菌肽所带的正电荷还有助于其在膜表面富集，从而达到有效杀菌浓度。由于两亲性的存在，抗菌肽分子在质膜上形成通道，破坏了脂质双层原有的有序结构，细菌失去膜电势，不能保持正常渗透压而死亡。在一定条件下，疏水性越大，抗菌肽的抗菌活性也就越强。但是疏水性过高，将会导致抗菌肽自身聚集，以致沉淀而析出，降低其抗菌活性，同时也会提高其溶血性。所以疏水性比例存在一个最优范围，在此范围内抗菌活性最高。另外，通过圆二色谱分析抗菌肽的二级结构特征，发现抗菌肽在一定条件下形成α
‑
螺旋结构。α
‑
螺旋是极好的水脂两亲结构，其圆柱形分子纵轴的一侧为带正电荷的亲水区，而对称面为疏水区，这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键，改变α
‑
螺旋结构将会影响抗菌肽的活性。
[0006]因此，本研究基于以上抗菌肽的特征设计并合成了具有优异抗菌活性的的新型阳离子两亲性抗菌糖脂肽GLP6，其中带正电荷的氨基酸赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)可以提供正电荷来静电吸引带负电荷的细菌膜。疏水性的色氨酸(Trp)由于芳族残基的π电子系统的强四极矩，产生了带负电荷的电子云，与细菌脂质双层中的阳离子分子(例如胆碱基团)相互作用，导致与细菌脂质膜的缔合时间延长。芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)与磷脂发生疏水性作用，产生生物学活性。专利技术人将本专利技术的抗菌糖脂肽全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。本专利技术抗菌糖脂肽在发挥靶向抗菌治疗的同时，抑制SPase I的活性(非膜靶向)，发挥协同抗菌作用，有效增强耐药菌对靶向抗菌糖脂肽的敏感度，从而进一步解决耐药菌耐药问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的之一在于根据膜靶向和非膜靶向(靶向SPase I)作用机制，利用固相合成技术制备一种具有优异抗菌活性的新型阳离子两亲性抗菌糖脂肽GLP6。本专利技术的第二个目的是将这种抗菌糖脂肽应用于治疗细菌感染。
[0008]为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0009]本专利技术阳离子两亲性抗菌糖脂肽GLP6的序列为C8H
15
O
‑
Ala
‑
Lys
‑
Ala
‑
Phe
‑
Leu
‑
Pro
‑
Ile
‑
Ile
‑
Arg
‑
Trp
‑
Lys
‑
Lys
‑
Arg
‑
Trp
‑
C6H
12
NO5(简写为C8H
15
O
‑
AKAFLPIIRWKKRW
‑
C6H
12
NO5)，其中Ala(A)为丙氨酸，Lys(K)为赖氨酸，Phe(F)为苯丙氨酸，Leu(L)为亮氨酸，Pro(P)为脯氨酸，Ile(I)为异亮氨酸，Arg(R)为精氨酸，Trp(W)为色氨酸，所接脂肪酸为正辛酸C8H
16
O2，所接糖分子为C6H
13
NO5。其设计方法如下：首先，根据天然抗菌肽的生物学特征(正电荷、疏水性和α
‑
螺旋结构)设计引入带正电荷的Lys、Arg和疏水性氨基酸Ala、Phe、Ile、Pro、Leu及Trp，同时偶联C8H
16
O2和C6H
13
NO5得到抗菌糖脂肽GLP6。根据所设计的抗菌糖脂肽序列，通过固相合成技术将侧链被保护的氨基酸在2
‑
Chlorotrityl Resin上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶联并脱除Fmoc保护基团得到多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌糖脂肽GLP6，其特征在于，所述抗菌糖脂肽GLP6从N端到C端的序列为C8H
15
O
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Ala
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Lys
‑
Ala
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Phe
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Leu
‑
Pro
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Ile
‑
Ile
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Arg
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Trp
‑
Lys
‑
Lys
‑
Arg
‑
Trp
‑
C6H
12
NO5(简写为C8H
15
O
‑
AKAFLPIIRWKKRW
‑
C6H
12
NO5)，其中Ala(A)为丙氨酸，Lys(K)为赖氨酸，Phe(F)为苯丙氨酸，Leu(L)为亮氨酸，Pro(P)为脯氨酸，Ile(I)为异亮氨酸，Arg(R)为精氨酸，Trp(W)为色氨酸，所接脂肪酸为正辛酸C8H
16
O2，所接糖分子为D
‑
(+)
‑
氨基葡萄糖C6H
13
NO5，抗菌糖脂肽结构式如下图所示：2.根据权利要求1的一种抗菌糖脂肽GLP6，其特征在于，其制备方法如下：(1)Fmoc
‑
Ala
‑
Lys(Boc)
‑
Ala
‑
Phe
‑
Leu
‑
Pro
‑
Ile
‑
Ile
‑
Arg(Pbf)
‑
Trp(Boc)
‑
Lys(Boc)
‑
Lys(Boc)
‑
Arg(Pbf)
‑
Trp(Boc)
‑2‑
Chlorotrityl Resin的合成。Fmoc
‑
氨基酸为原料，使用Fmoc保护的负载量为0.59mmol/g的Trp(Boc)
‑2‑
Chlorotrityl Resin作为合成的载体，DCC/HOBt/DIEA为缩合试剂。首先称取Fmoc
‑
Trp(Boc)
‑2‑
Chlorotrityl Resin于反应容器中，室温、无水条件下加入DMF溶胀，待树脂充分溶胀后，抽滤去除多余DMF。茚三酮检验(茚检试剂为茚三酮：吡啶：苯酚＝1：2：1)，若无色则继续下面的步骤。加入V(哌啶)：V(DMF)＝1：4的混合溶液搅拌以脱除Fmoc保护基。搅拌结束后，抽滤，并依次使用DMF、DCM、DMF冲洗。随即将树脂转移至反应容器中，茚检，若显示蓝紫色，将树脂再次加入DMF溶胀。取2倍摩尔量的Fmoc
‑
Arg(Pbf)
‑
OH，以2.6倍摩尔量的DCC、HOBt及DIEA为缩合剂，无水DMF为反应溶剂，将氨基酸和缩合剂分别加入，搅拌反应48h。茚检，若显无色则可以进行下一个氨基酸的偶联。将反应完成的树脂分别用DMF、DCM、DMF冲洗，除去未反应的氨基酸及催化剂，将样品转移至透析袋内(MW：8000
‑
14000)，用乙醇进行透析。重复上述步骤依次从C端到N端逐个偶联氨基酸，直至合成Fmoc
‑
Ala
‑
Lys(Boc)
‑
Ala
‑
Phe
‑
Leu
‑
Pro
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Ile
‑
Ile
‑
Arg(Pbf)
‑
Trp(Boc)
‑
Lys(Boc)
‑
Lys(Boc)
‑
Arg(Pbf)
‑
Trp(Boc)
‑2‑
Chlorotrityl Resin。(2)脂肽树脂LP6
‑2‑
Chlorotrityl Resin(C8H
15
O
‑
Ala
‑
Lys
‑
Ala
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Phe
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Leu
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Pro
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Ile
‑
Ile
‑
Arg
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Trp
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Lys
‑
Lys
‑
Arg
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Trp
‑2‑
Chlorotrityl Resin)的合成：脱除(1)中所得多肽树脂的Fmoc保护基。取2倍摩尔量的正辛酸，以2.5倍摩尔量的NHS及EDC为连接剂，将脂肪酸和连接剂以无水DMF为反应溶剂搅拌活化。活化完成后，将冷冻干燥的上述多肽树脂加入，搅拌反应48h。将反应完成的树脂分别用DMF、DCM、DMF冲洗抽滤，除去未反应的脂肪酸及连接剂，用乙醇进行透析。透析结束后，将树脂从透析袋中取出并用无水乙醇冲洗后，冷冻干燥，得到LP6
‑2‑
Chlorotrityl Resin(C8H
15
O
‑
Ala
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏光成，牛明聪，毕书涵，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：