过表达翻译因子的宿主细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种表达目的基因(GOI)的重组真核宿主细胞，所述重组真核宿主细胞通过遗传修饰工程化以与所述一种或多种遗传修饰之前的宿主细胞相比，增加编码信使核糖核蛋白(mRNP)的翻译起始因子的两种或更多种基因(TIF基因)的表达，其中所述TIF基因至少包括编码eIF4A的基因和编码eIF4G的基因，并且其中所述TIF基因中的至少一者的表达在启动子(该启动子不同于控制所述GOI的表达的启动子)的转录控制下。录控制下。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】过表达翻译因子的宿主细胞


[0001]本专利技术涉及改善重组蛋白生产的产量和经工程化以增加一种或多种翻译因子的表达的宿主细胞。

技术介绍

[0002]在重组宿主细胞培养物中生产的蛋白质作为诊断剂和治疗剂变得越来越重要。为此，对细胞进行工程化和/或选择以生产异常高水平的重组或异源目的蛋白(protein of interest)。
[0003]已经在细胞培养物中使用真核宿主细胞成功生产了目的蛋白(POI)。真核宿主细胞(特别是哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌、或细菌)通常用作生物制药蛋白质以及散装化学品的生产宿主。最突出的实例是甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，其以高效分泌异源蛋白质而闻名。2005年，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)已经被重新分类为新属孔玛氏酵母(Komagataella)，并且被分为三个物种，巴斯德孔玛氏酵母(K.pastoris)、菲氏孔玛氏酵母(K.phaffii)和假巴斯德孔玛氏酵母(K.pseudopastoris)。通常用于生物技术应用的菌株属于两个提出的物种，巴斯德孔玛氏酵母和菲氏孔玛氏酵母。菌株GS115、X
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33、CBS2612和CBS7435是菲氏孔玛氏酵母，而菌株DSMZ70382被归为巴斯德孔玛氏酵母模式种，它是所有可用的巴斯德毕赤酵母菌株的参考菌株(Kurtzman 2009,J Ind Microbiol Biotechnol.36(11):1435
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8)。Mattanovich等人(Microbial Cell Factories 2009,8:29doi:10.1186/1475
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29)描述了巴斯德孔玛氏酵母模式株DSMZ70382的基因组测序，并且分析了其分泌蛋白质组和糖转运蛋白。
[0004]核糖体是进行蛋白质合成的复杂核糖核蛋白组装体。信使核糖核蛋白(mRNP)是mRNA
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蛋白质复合物，其中转录物由一组变化的蛋白质结合，该蛋白质介导构成转录物生命周期的共转录和转录后事件。转录物首先经过5'端加帽、在许多情况下的剪接、3'切割和聚腺苷酸化、核外泌体的mRNA质量控制以及输出因子募集。然后它们被输出到细胞质，其中一些在细胞质中经历特异性亚细胞定位。转录物最终会被翻译(常常以受控方式)并被降解。
[0005]翻译起始在重组蛋白生产的关键途径上。正在讨论由mRNA、多种真核起始因子(eIF)和核糖体蛋白质构成的闭环结构的形成有助于翻译起始，并且因此提高整体翻译效率。
[0006]Mead等人(Biochem.J.2015,472:261
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273)描述了闭环的关键组分(eIF(eIF3a、eIF3b、eIF3c、eIF3h、eIF3i和eIF4G1)、poly(A)结合蛋白(PABP)1和PABP相互作用蛋白1(PAIP1))在30个生产单克隆抗体(mAb)的重组CHO细胞系的组中的mRNA和蛋白质水平。发现了高产细胞系以维持参与闭环mRNA的形成的翻译起始因子的量，从而将这些蛋白质维持在适当的水平以提供增强的重组蛋白生产。
[0007]eIF4F复合物由帽结合蛋白eIF4E、eIF4G和RNA解旋酶eIF4A构成。eIF4G是带有PABP(PAB1)、eIF4E、eIF4A和(在哺乳动物中的)eIF3的结合结构域的支架蛋白。酵母和人eIF4G也都结合RNA。eIF4G中eIF4E和PABP的结合结构域及其RNA结合活性使eIF4G能够经由
mRNA体中的帽、poly(A)尾和序列协调与mRNA的独立相互作用以组装稳定的环状信使核糖核蛋白(mRNP)，称为“闭环”结构。
[0008]闭环模型提出mRNA的5'端和3'端经由桥接机制相互作用，该桥接机制由包括数种翻译起始因子在内的多个蛋白质介导。闭环的核心桥在5'
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帽、eIF4F(由eIF4A、eIF4E和eIF4G组成)、eIF3、poly(A)结合蛋白(PABP)相互作用蛋白1(PAIP1)、PABP1和poly(A)尾之间形成。普遍认为，这种mRNA环化通过增强核糖体的循环和/或通过确保eIF4F保持与mRNA的栓系且不必在每一轮翻译起始时都从游离eIF4F池中重新募集而提高翻译率。真核生物中翻译的延伸、终止和循环阶段由Dever等人(Cold Spring Harb Perspect Biol 2012；4:a013706)和Hinnebusch等人(Cold Spring Harb Perspect Biol 2012；4:a011544)综述。
[0009]Roobol等人(Metabolic Engineering 2020,59:98
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105)检查了哺乳动物细胞系HEK和CHO细胞系中大eIF3复合物的eIF3i和eIF3v亚基的瞬时和稳定过表达分别对生长速率增加、蛋白质合成容量增加和细胞凋亡延迟的作用。eIF3i是真核起始因子3(eIF3)复合物的组分，该复合物包含12个不同亚基的单拷贝，其中5个亚基a、b、c、g和i从酵母到哺乳动物在体内都是保守的和必需的。
[0010]Archer等人(RNA Biol.2015Mar；12(3):248
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254)研究了酵母中通过帽结构、poly(A)尾、eIF4E、eIF4G和PAB之间的相互作用形成的mRNA闭环。
[0011]Chan等人(eLife 2018；7:e32536)描述了抑制翻译起始会破坏单个转录物的稳定性并导致酵母中mRNA衰变加速。eIF4E的5'帽结合突变体的过表达导致了对生长的微妙抑制。同时下调eIF4E和eIF4G后，即观察到强烈的合成生长缺陷。
[0012]39S和57S翻译复合物中存在的翻译起始因子eIF4E、eIF4G1和eIF4G2与PAB1共纯化。此类复合物含有闭环因子eIF4E、eIF4G和PAB1，通过与mRNA帽结合的eIF4E以及与多聚腺苷酸尾结合的PAB1而与mRNA明显缔合(参见Denis et al.Nature Scientific Reports 2018,8:11468)。
[0013]已知RLI1对于核糖体循环很重要，并且需要有效的终止密码子识别，从而刺激翻译终止。然而，RLI1在翻译起始和核糖体生物发生中具有双重功能。Yarunin等人(The EMBO Journal2005,24:580
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588)描述了RLI1在与前体40S颗粒和成熟40S亚基相关联的核糖体形成中发挥作用。RLI1与MFC组分和40S核糖体特异性缔合(Dong et al.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2004,279(40):42157
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42168)。
[0014]Liao等人(Biotechnol Lett(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种表达目的基因(GOI)的重组真核宿主细胞，所述重组真核宿主细胞通过遗传修饰工程化以与所述一种或多种遗传修饰之前的宿主细胞相比，增加编码信使核糖核蛋白(mRNP)的翻译起始因子的两种或更多种基因(TIF基因)的表达，其中所述TIF基因至少包括编码eIF4A的基因和编码eIF4G的基因，并且其中所述TIF基因中的至少一者的表达在不同于控制所述GOI的表达的启动子的启动子的转录控制下。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中a)所述eIF4A与SEQ ID NO:12
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33中的任一者具有至少60％序列同一性；并且b)所述eIF4G与SEQ ID NO:34
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44中的任一者具有至少60％序列同一性。3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述TIF基因进一步包括以下中的任何一者或多者a)编码eIF4E的基因；b)编码PAB1的基因；或c)编码RLI1的基因。4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中a)所述eIF4E与SEQ ID NO:1
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11中的任一者具有至少60％序列同一性；b)所述PAB1与SEQ ID NO:45
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55中的任一者具有至少60％序列同一性；并且c)所述RLI1与SEQ ID NO:56
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65中的任一者具有至少60％序列同一性。5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述TIF基因中的一者或多者被优化以用于在宿主细胞中表达所述TIF基因。6.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其过表达至少以下各项：a)编码eIF4A和eIF4G的基因；b)编码eIF4A、eIF4G和eIF4E的基因；c)编码eIF4A、eIF4G、eIF4E和PAB1的基因；d)编码eIF4A、eIF4G和PAB1的基因。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞被另外工程化以过表达编码RLI1的基因。8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括以下者的敲入、取代、中断、缺失或敲除：(i)一个或多个多核苷酸或其一部分；或(ii)表达控制序列，优选地，选自由启动子、核糖体结合位点、转录或翻译起始和终止序列、增强子和激活子序列组成的组的表达控制序列，优选地其中所述一种或多种遗传修饰包括将异源多核苷酸或表达盒整合到宿主细胞基因组中。9.根据权利要求1至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述遗传修饰包括增加所述TIF基因的数量或包含所述TIF基因的表达盒的数量，和/或所述TIF基因中的功能获得性改变，从而增加所述TIF基因的水平或活性。10.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述TIF基因对所述宿主细胞是内源的或异源的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的宿主细胞，其包含a)表达系统，其在一个或多个异源TIF表达盒中表达所述TIF基因中的一者或多者，每个表达盒包含一个或多个与所述TIF基因可操作地连接的表达控制序列；和
b)GOI表达盒，其包含GOI和一个或多个与所述GOI可操作地连接的表达控制序列；其中a)的所述表达系统和b)的所述表达盒经工程化以当在细胞培养物中培养所述宿主细胞时表达相应TIF基因和GOI。12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中a)所述TIF表达盒中的至少一者包含组成型启动子；和/或b)所述GOI表达盒包含诱导型、去阻抑型或其他可调控启动子，或组成型启动子。13.根据权利要求1至12中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：龙沙有限公司，
类型：发明
国别省市：