具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f-12及其应用制造技术

具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f

【技术实现步骤摘要】
具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
‑
12及其应用


[0001]本专利技术涉及烟草内生菌领域，特别涉及具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12及其应用。

技术介绍

[0002]烟草是我国重要的叶用经济作物，而尼古丁是烟叶中主要的生物碱，占总生物碱的95％，其含量与烟草的类型、农业技术措施、调制方法以及自然条件等因素有关，同时，烟叶中尼古丁的含量与烤烟的品质密切相关。
[0003]近年来，由于我国烤烟进行的打顶等农艺措施，烟株根系的尼古丁合成能力显著提高，不同部位的烟叶尼古丁分配和积累迅速增加，尤其是上部烟叶的尼古丁含量偏高，这导致烟叶内在化学成分的协调性显著下降，严重影响烟叶的品质及评吸质量，烟叶的可用性降低。此外，近年来，降焦减害成为我国卷烟的重要趋势，烟叶中的尼古丁是危害身体健康的重要因素之一，因此，降低烟叶中的尼古丁含量是烟叶生产过程中一个十分重要的环节，本专利技术提出的烟草品种云烟87中分离出的几株内生真菌能有效降解尼古丁。
[0004]在我们对云南烟草优势品种云烟87的内生真菌菌群的研究中，共从田间采摘的云烟87烟株中分离出103株内生真菌，共52种，隶属于29个属。其中，上部叶有10个属共11种内生真菌，中部叶有7个属共8种内生真菌，下部叶有6个属共8种内生真菌，茎部有9个属共11种内生真菌，粗根有12个属共21种内生真菌，须根有5个属共7种内生真菌。经筛选，共有5种内生真菌能降解尼古丁。

技术实现思路

[0005]为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12及其应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0007]具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12，所述的烟草内生真菌001f
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12为：炭角菌属001f
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12，炭角菌属(Xylaria.sp.)001f
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12菌落呈白色，辐射匍匐生长，培养基表面菌丝生长紧密，菌落边缘呈雪花状；其由如下方法获得：取田间自然生长的健康云烟87植株，分别对粗根、须根、茎、上部叶、中部叶、下部叶六个部位进行消毒，将烟草组织接种于固体培养基上，进行内生真菌的培养得到。
[0008]进一步的，所述云烟87内生真菌的培养方式，固体培养为：培养温度28℃，培养时间5～7天；液体培养：将上述内生真菌菌株接于液体培养基中，于摇床震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h。
[0009]进一步的，所述云烟87内生真菌的培养基，分为固体培养基和液体培养基，固体培养基使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(46g/L)，121℃高压蒸汽灭菌20min，加入链霉素(10mg/L)；液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤(25g/L)，121℃高压蒸汽灭菌20min，加入链霉素(10mg/L)。
[0010]进一步的，所述的液体培养基为，在液体培养基中加入尼古丁标准品，用于内生真菌发酵。
[0011]进一步的，具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12鉴定方法为：用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行rDNAITS的PCR扩增，并对ITS PCR扩增产物进行测序，将所得序列在GenBank核算序列数据库中进行BLAST搜索，发现测试菌株的ITS区域分别与已报道的尖孢镰刀菌、Aspergillus lentulus、土曲霉、Ovatosporabrasiliensi、Irpex lacteus同源性最高，结合形态学鉴定，确定为炭角菌属001f
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12。
[0012]上述具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12在烟草尼古丁减少或分解方面的应用。
[0013]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0014]具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12及其应用；采用HPLC对烟草内生真菌发酵液提取物的成分进行检测，结果显示，尼古丁标准品出峰时间为15.539，而本专利技术内生真菌的发酵菌液在误差允许的时间范围内，没有在相应的保留时间检测到尼古丁，表明这1株内生真菌降解了培养基中的尼古丁成分。通过高效液相的方法，和已知标准品进行对比，表明专利技术所涉及内生真菌能有效地降解尼古丁，为降低烟叶尤其是上部叶中尼古丁含量提供可能。
附图说明
[0015]图1烟草育苗盘及播种方式；
[0016]图2本专利技术内生真菌的形态；
[0017]图3本专利技术内生真菌发酵图；
[0018]图4是标准品及真菌发酵液HPLC图。
具体实施方式
[0019]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术技术方案做进一步详细描述：
[0020]如图1
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4所示，具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12及其应用。
[0021]实施例1云烟87内生真菌的分离、纯化
[0022]内生真菌的分离包括：
[0023]A、材料处理：将从田间采收的云烟87植株分成上部叶、中部叶、下部叶、烟茎、粗根、须根六个部分；
[0024]B、材料消毒：上部叶、中部叶、下部叶：75％酒精浸泡30s—0.1％升汞浸泡15s—无菌水冲洗3次；烟茎：75％酒精擦拭表皮
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保留皮层及中柱；粗根、须根：75％酒精浸泡60s—0.1％升汞浸泡20s—无菌水冲洗3次，将最后一次冲洗后的无菌水划线于平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底；
[0025]C、接种分离、纯化：将烟叶部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分加入无菌水进行研磨处理，将研磨液和残渣均匀的铺放在培养基表面，全部材料放于28℃恒温培养箱中培养5～7天，观察菌落生长状况。由于不同真菌的繁殖速度不同，可以优先分离纯化生长较快的菌
株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。
[0026]实施例2云烟87内生真菌发酵培养及尼古丁施加
[0027]从实施例1中培养的云烟87内生真菌培养基中挑取少许菌丝加入到100ml液体培养基中，装入250ml锥形瓶内，瓶口封膜，于摇床震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h；
[0028]该液体培养基配方：马铃薯葡萄糖肉汤(25g/L)，121℃高压蒸汽灭菌20min，加入链霉素，所述链霉素浓度为10mg/L。
[0029]对液体培养基进行尼古丁处理，于液体培养基中加入1mg尼古丁标准品，进行内生真菌发酵。
[0030]实施例3次HPLC法检测内生真菌发酵液中的尼古丁
[0031]标准品溶液的制备：取尼古丁标准品1mg，精密本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12，其特征在于，所述的烟草内生真菌001f
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12为：炭角菌属001f
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12，炭角菌属(Xylaria.sp.)001f
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12菌落呈白色，辐射匍匐生长，培养基表面菌丝生长紧密，菌落边缘呈雪花状；其由如下方法获得：取田间自然生长的健康云烟87植株，分别对粗根、须根、茎、上部叶、中部叶、下部叶六个部位进行消毒，将烟草组织接种于固体培养基上，进行内生真菌的培养得到。2.根据权利要求1所述的具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12，其特征在于，所述云烟87内生真菌的培养方式，固体培养为：培养温度28℃，培养时间5～7天；液体培养：将上述内生真菌菌株接于液体培养基中，于摇床震荡培养，培养温度30℃，转速220rpm，培养时间48～72h。3.根据权利要求1所述的具有分解尼古丁能力的烟草内生真菌001f
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12，其特征在于，所述云烟87内生真菌的培养基，分为固体培养基和液体培养基，固体培养基使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(46g/L)，121℃高压蒸汽灭菌20min，加入链...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝冰，胡浩洋，谢家伟，刘彦中，王慧明，杨景栋，彭小祠，孙晨，孟金朋，罗杰，杨皓若，杜江顺，康乐怡，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：