检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因相关突变位点的引物和探针组合及方法技术

本发明专利技术公开了检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因相关突变位点的引物和探针组合及方法，所述引物和探针组合包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.13所示的引物和SEQ ID No.14～SEQ ID No.22所示的探针；其中，分子信标探针中添加锁核酸碱基，位于突变对应的位置。本发明专利技术采用“突变阻滞扩增(ARMS)、分子信标探针(Molecular Beacon)和锁核酸(LNA)”联合使用检测左氧氟沙星耐药的方法，通过对引物和探针的合理设计和组合，采用降落荧光PCR技术达到检测目的。该方法灵敏度高、特异性强、速度快、操作简单方便，具有很大的推广价值。具有很大的推广价值。具有很大的推广价值。

【技术实现步骤摘要】
检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因相关突变位点的引物和探针组合及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及用于幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药突变检测的方法，本专利技术还涉及到利用所述的引物探针相组合检测HP左氧氟沙星耐药的试剂盒。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)作为全球流行的细菌，近年来越来越受到大众的关注。HP是胃部疾病的罪魁祸首，与胃炎、胃溃疡、胃粘膜组织淋巴瘤等密切相关。左氧氟沙星作为一种喹诺酮类抗生素，在幽门螺杆菌治疗中有着重要的作用，常与其他药物联合使用，形成方案。然而，左氧氟沙星的特点是产生耐药性很快，因此，在使用前要明确其是否耐药。传统的药物敏感性方法，要经过细菌分离培养以后，再进行相应的试验来判断。幽门螺杆菌作为一种微需氧菌，生长缓慢，培养和分离非常困难，需要7～10天才能得到细菌，然后再经历3天以上的时间，才能得到药敏试验结果，整个过程耗时长，成功率低，并且需要在胃镜下取胃粘膜才能完成。由于HP分离培养的难度和时效性，限制了“培养+药敏”的方法在临床的使用。因此使用分子生物检测HP左氧氟沙星耐药是更为合适的选择。
[0003]HP左氧氟沙星耐药的主要原因是由于其喹诺酮耐药决定区相关基因突变引起的，主要是gyrA基因的261位点和271/272位点的单核苷酸多态性引起的，其中261位点为C和T时候为敏感型，A和G时候为耐药型，271位点有两种突变G＞A和G＞T，272位点为A＞G。由于左氧氟沙星相关耐药突变位点较多，因此给实际检测工作造成了难度。目前所使用的基于核酸的SNP检测方法，单一时候时候均不能达到理想的效果。
[0004]申请人专利技术了一种采用“突变阻滞扩增(ARMS)、分子信标探针(Molecular Beacon)和锁核酸(LNA)”联合使用检测左氧氟沙星耐药的方法，通过对引物和探针的合理设计和组合，采用降落荧光PCR技术达到检测目的。该方法灵敏度高、特异性强、速度快、操作简单方便，具有很大的推广价值。。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题为：提供一种检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药的引物、探针组合及方法，以实现HP左氧氟沙星耐药的检测目的。
[0006]本专利技术的技术方案为：检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyrA261、271、272相关突变位点的引物和探针组合，包括：ARMS引物，分子信标引物和探针，所述ARMS引物由引物261C野生ARMS
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F、261T野生ARMS
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F、261A突变ARMS
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F、261G突变ARMS
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F、271G野生ARMS
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F、271T突变ARMS
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F、271A突变ARMS
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F、272A野生ARMS
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F、272G突变ARMS
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F、HP gyrA ARMS
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R组成，所述分子信标引物由引物HP gyrA MBeacon
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261F、HP gyrA MBeacon
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271F、HP gyrA MBeacon
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R组成，所述探针由探针261C野生
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MBeacon
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P、261T野生
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MBeacon
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P、261A突变
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MBeacon
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P、261G突变
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MBeacon
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P、271G野生
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MBeacon
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P、271T突变
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MBeacon
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P、271A突变
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MBeacon
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P、272A野生
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MBeacon
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P、272G野生
‑
MBeacon
‑
P组成；
[0007]所述261C野生ARMS
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，261T野生ARMS
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，261A突变ARMS
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，261G突变ARMS
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，71G野生ARMS
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，271T突变ARMS
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，271A突变ARMS
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，272A野生ARMS
‑
F的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示，272G突变ARMS
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，HP gyrA ARMS
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述引物HP gyrA MBeacon
‑
261F的核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示，HP gyrA MBeacon
‑
271F的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，HP gyrA MBeacon
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述探针261C野生
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，且从5
’
端起第21个碱基C为锁核酸；261T野生
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，且从5
’
端起第21个碱基T为锁核酸；261A突变
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，且从5
’
端起第21个碱基A为锁核酸；261G突变
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，且从5
’
端起第21个碱基C为锁核酸；271G野生
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，且从5
’
端起第17个碱基G为锁核酸；271T突变
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，且从5
’
端起第17个碱基T为锁核酸；271A突变
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，且从5
’
端起第17个碱基A为锁核酸；272A野生
‑
MBeacon
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyrA261、271、272相关突变位点的引物和探针组合，其特征在于，包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.13所示的引物和SEQ ID No.14～SEQ ID No.22所示的探针；其中，SEQ ID No.14所示核苷酸序列从5
’
端起第21个碱基C为锁核酸；SEQ ID No.15所示核苷酸序列从5
’
端起第21个碱基T为锁核酸；SEQ ID No.16所示核苷酸序列从5
’
端起第21个碱基A为锁核酸；SEQ ID No.17所示核苷酸序列从5
’
端起第21个碱基C为锁核酸；SEQ ID No.18所示核苷酸序列从5
’
端起第17个碱基G为锁核酸；SEQ ID No.19所示核苷酸序列从5
’
端起第17个碱基T为锁核酸；SEQ ID No.20所示核苷酸序列从5
’
端起第17个碱基A为锁核酸；SEQ ID No.21所示核苷酸序列从5
’
端起第19个碱基A为锁核酸；SEQ ID No.22所示核苷酸序列从5
’
端起第21个碱基G为锁核酸。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示的野生探针5
′
端标记发光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国栋，王琦，王南苗，
申请(专利权)人：苏州长柏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：