一种表达红霉素降解酶EreA的布拉迪酵母的构建及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达红霉素降解酶EreA的布拉迪酵母的构建及应用。本发明专利技术首先构建尿嘧啶营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3

【技术实现步骤摘要】
一种表达红霉素降解酶EreA的布拉迪酵母的构建及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达红霉素降解酶EreA的布拉迪酵母的构建及应用。

技术介绍

[0002]自1928年Alexander Fleming发现了第一个抗生素青霉素，抗生素成为人和动物不可替代的医疗产品。一项调查预测，全球抗菌素消费量将增加67.0％，从63151
±
1560吨(2010年)增至105596
±
3605吨(2030年)。我国2020和2021年兽医公报显示在2019和2020年全国大环内酯类抗生素分别消耗3020.05和3266.309吨，占比全年抗生素消费总量的9.77％和9.97％，连续两年位居第四位。其中，红霉素是使用最广泛的大环内酯类抗生素之一，并且由于其在环境中的持久性而成为顽固污染物。红霉素广泛用于牲畜的生长促进剂，红霉素在小肠内代谢吸收，残留的红霉素以原形随粪便排出体外，大约一半的口服红霉素以20mg/kg的剂量排泄到粪便中。因此，动物粪便是环境中抗生素污染的主要来源之一。药物和个人护理产品(Pharmaceutical andPersonal Care Products，PPCPs)被定义为一类新兴的环境污染物，因为它们在低剂量下会对人体产生代谢影响的内在危害，故对环境中的红霉素进行消除具有重要意义。
[0003]现有的抗生素消除方法分为生物消除和非生物消除，两者大多是对环境中的抗生素进行消除，几乎没有源头消除抗生素残留的方法。Minrui Liu等人[J Hazard Mater.2020Apr15,388:122032]公开了一种以大肠杆菌为宿主菌表达红霉素酯酶以降低动物粪便中抗生素残留的方法。然而，据我们所知，细菌作为表面表达ereA的宿主菌具有生物安全风险。并且其筛选阳性转化子的过程中使用抗生素作为选择压力，可以避免由于分离或结构不稳定性而引起的质粒丢失。但使用抗生素抗性作为选择标记需要在整个培养器件供应抗生素，成本较高。
[0004]酵母作为一种表达重组蛋白的工具，近年来受到越来越多的关注。S.boulardii益生菌产品已在全球范围内获批上市，并且在预防和治疗抗生素相关腹泻、旅行者腹泻、HIV/AIDS相关腹泻、儿童急性胃肠炎和艰难梭菌的重复感染等疾病中具有良好效果，极少报道菌血症等不良反应。鉴于其优异的益生作用，越来越多的国外公司在膳食补充剂中使用布拉迪酵母。另外，我国2017年国家卫计委新食品原料受理中的食新进申字(2017)第0001号也已经开始受理了S.boulardii作为新食品原料的申报。目前关于利用S.boulardii表达红霉素降解酶EreA的研究未见报道。

技术实现思路

[0005]针对目前现有技术存在的不足，本专利技术提供一种能够实现肠道原位降解红霉素的益生菌S.boulardii。本专利技术主要针对源头进行抗生素消除，以S.boulardii作为表达ereA的宿主菌，一方面可以在发挥其自身原有的益生功能同时实现对红霉素残留的源头(肠道)消除，最大限度地避免红霉素流入到周围环境。另一方面可避开以往基因工程菌的缺陷，杜
绝了临床重要耐药基因ereA的外泄风险。
[0006]本专利技术的首要目的在于提供一种表达红霉素降解酶EreA的工程益生菌S.boulardii。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供一种表达红霉素降解酶EreA的工程益生菌S.boulardii的构建方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0009]一种表达红霉素降解酶EreA的工程益生菌S.boulardii，其构建方法包括如下步骤：
[0010]S1、构建尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3
‑
/
‑
；
[0011]S2、将携带opereA基因插入到含URA3基因的质粒pURA中，构建并提取阳性转化子质粒；
[0012]S3、将步骤S2所提取的阳性转化子质粒转化至步骤S1所述尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3
‑
/
‑
制备好的感受态中，转化液涂布至培养基筛选获得表达红霉素降解酶EreA工程益生菌。
[0013]在我们的前期实验过程中，发现显示抗性质粒转入酵母中，即使使用抗生素去施加外加压力，但在培养后期随着培养过程中菌体密度增大，以抗生素作为标记的质粒依然会出现容易丢失的情况，这严重影响了阳性转化子的筛选效率。因此，我们选用尿嘧啶(Uracil)作为筛选标记，敲除原菌URA3基因，将含URA3基因的质粒转入菌株，这样只要出现丢失质粒的菌都因无法合成尿嘧啶而死亡，存活的菌株均为含有质粒的菌株，提高了活菌中的质粒携带率，可提高表达水平。
[0014]本专利技术为了最大程度提高红霉素降解酶EreA的表达量，使用了优化过后的密码子序列进行表达，所述opereA基因是经序列优化后的ereA，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0015]优选地，为了稳定地表达降解酶，步骤S1所述尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型S.boulardi菌株的构建方法为：通过构建选自G418抗性(Kan)和Zeocin抗性(ble)抗性基因的同源臂，将其逐一插入替换到S.boulardi染色体上URA3的等位基因上，再利用LoxP/Cre重组酶系统，去除抗性基因得到。
[0016]本专利技术对步骤S1所述尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3
‑
/
‑
构建是否成功进行验证，利用YPD培养基、SD/
‑
Ura培养基、5
‑
FOA培养基上37℃培养2d验证URA3基因缺失表型；利用G418 YPD培养基、含Zeocin YPD培养基、含G418和Zeocin培养基上37℃培养2d验证Kan、ble基因插入及删除的表型。
[0017]本专利技术中S.boulardii/URA3
‑
/
‑
由于URA3基因的缺失不能在缺少Uracil的营养缺陷型培养基(SD/
‑
Ura培养基)上生长，但是可以在添加了Uracil和5
‑
FOA的培养基上(5
‑
FOA培养基)生长，证明了菌株URA3基因被敲除。S.boulardii/URA3
‑
/
‑
由于缺乏抗性不能在各药板上生长。从基因型和表型两方面验证均证明成功构建尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株S.boulardi/URA3
‑
/
‑
。
[0018]本专利技术分别构建了质粒和染色体介导的工程益生菌酵母，比较了红霉素降解酶的表达水平，筛选得到以质粒介导的工程益生菌酵母具有红霉素降解酶EreA的高水平表达。
[0019]本专利技术的第三个目的在于提供了所述的工程益本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达红霉素降解酶EreA的工程益生菌S.boulardii的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建尿嘧啶营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3
‑
/
‑
；S2、质粒的构建：将携带opereA基因插入到含URA3基因的质粒pURA中，构建并提取阳性转化子质粒；S3、将步骤S2所提取阳性转化子质粒转化至步骤S1所述尿嘧啶营养缺陷型菌株S.boulardi/URA3
‑
/
‑
制备好的感受态中，转化液涂布至培养基筛选获得表达红霉素降解酶EreA工程益生菌；所述opereA基因是经序列优化后的ereA，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1所述尿嘧啶营养缺陷型S.boulardi菌株的构建具体步骤为，通过构建选自G418抗性Kan和Zeocin抗性ble抗性基因的同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙坚，贺骞，林卓宇，张晓净，廖晓萍，刘雅红，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室，
类型：发明
国别省市：