一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法技术

本发明专利技术属于生物荧光检测技术领域，公开了一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，设计秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达量的实时定量PCR检测引物组；从待测秦岭细鳞鲑样品中提取总RNA；以待测秦岭细鳞鲑样品总RNA为模板合成cDNA第一链；加入秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达量的实时定量PCR检测引物组，以β

【技术实现步骤摘要】
一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法


[0001]本专利技术属于生物荧光检测
，尤其涉及一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法。

技术介绍

[0002]目前，视蛋白(Opsin)是一种约含有350个左右氨基酸残基的跨膜蛋白，属于G蛋白偶联受体家族。根据其对视觉成像是否有直接作用而分视觉系统视蛋白和非视觉系统视蛋白两大类。视觉视蛋白是感光色素的重要组成部分，其通过与生色基团(chromophore)共价结合形成的视色素分子介导视觉传递的第一步。视觉视蛋白主要存在于视杆细胞和视锥细胞中，在视觉图像形成方面起着至关重要的作用。视杆细胞中的视蛋白为视紫红质(Rhodopsin)，光敏性强，主要负责感受光线强弱以及对图像的捕捉，可以辨别物体的轮廓特征。视锥细胞中的视蛋白主要介导明视觉，是鱼类区分颜色的分子基础，根据吸收光谱范围的不同又可分为以下4种：长波长敏感视蛋白(Long wave sensitive opsin，LWS)；中波长敏感视蛋白(RH2)；短波长敏感视蛋白(Shortwave sensitive opsin2，SWS2)；超短波长敏感视蛋白(Shortwave sensitive opsin 1，SWS1)。
[0003]Rhodopsin对水生脊椎动物至关重要，尤其是生活在深海或者黑暗环境中的硬骨鱼，其依靠图像捕捉的能力来寻找食物和配偶，并维持各种种间和种内关联，这些关联对它们的适应性有选择性影响。Rhodopsin作为直接参与视觉成像的视觉视蛋白基因，不仅对外界不断变化的光环境的视觉和信号系统适应方面发挥重要作用，而且在物种的进化上也具有重要影响。鱼类的视觉视蛋白具有发育可塑性表达，通过在不同发育时期的动态变化来调整其光谱敏感性，以此适应水体光环境变化的需要。
[0004]秦岭细鳞鲑(Brachymystax tsinlingensis Li，1966)隶属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、细鳞鲑属(Brachymystax)，俗称梅花鱼，为我国特有的陆封型冷水性鱼类。由于秦岭细鳞鲑应激性强、生境条件苛刻、生长缓慢，加之人为过度捕捞等影响，导致秦岭细鳞鲑野生种群数量急剧锐减，种质资源破坏严重，已在1998年被列入国家二级保护动物。秦岭细鳞鲑与其它同科鱼类一样，是以“筑巢埋卵”的方式进行避光自然繁殖，在秦岭细鳞鲑的早期发育过程中，光照会严重影响到受精卵的孵化周期甚至存活，本专利技术在前期育苗研究中也发现，光环境确是影响秦岭细鳞鲑苗种成活的关键因子之一，但迄今为止有关秦岭细鳞鲑视觉系统的研究资料比较少，且作为直接感受光照强弱的Rhodopsin基因的表达模式的研究仍处于空白阶段。
[0005]实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程中每一个循环扩增产物量的变化，最后对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该方法安全无污染，操作简单快速，具有极高的灵敏性、精确性和特异性。该技术已被广泛应用于分子生物学和医学等研究领域。目前，现有技术中还没有通过定量PCR分析秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达情况的报道，故亟需设计一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法。
[0006]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于通过定量PCR分析秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达情况的实时定量PCR检测引物组及其相关技术方案尚未见报道。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，尤其涉及一种基于实时荧光定量RT
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PCR技术检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因相对表达量的方法。
[0008]本专利技术是这样实现的，一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法包括：设计秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达量的实时定量PCR检测引物组，包括符合荧光反应特点的Rhodopsin基因引物对以及β
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actin引物对；从待测秦岭细鳞鲑样品中提取得到纯化的总RNA；以待测秦岭细鳞鲑样品总RNA为模板合成cDNA第一链；以待测秦岭细鳞鲑样品总cDNA为模板，加入秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达量的实时定量PCR检测引物组，以β
‑
actin为内参，利用LightCycle 96荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测；根据LightCycler 96SW 1.1软件的定量结果，以β
‑
actin作为参照基因，采用2
‑
ΔΔCt
法计算秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因的相对表达水平。
[0009]进一步，计算秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因的相对表达水平包括：
[0010]求出每个待测秦岭细鳞鲑样品的目的基因Ct值和内参基因的Ct值的差值并进行单因素分差分析，差值的结果用于反应基因表达水平；再找出差值最大的时期设为对照组，计算得到不同时期之间的相对表达量。
[0011]进一步，检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法包括以下步骤：
[0012]步骤一，引物设计与合成：根据基因克隆得到的秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因序列，使用Premier 5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物；
[0013]步骤二，RNA提取及cDNA合成：提取秦岭细鳞鲑样品RNA，以RNA为模板，利用RevertAid反转录预混液试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链；
[0014]步骤三，荧光定量PCR反应：配制实时荧光PCR反应体系并设置实时荧光定量PCR反应程序后进行实时荧光PCR反应，再进行数据处理及分析。
[0015]进一步，步骤一中，内参基因β
‑
actin根据转录组uni
‑
gene结果设计引物，适用于秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因荧光定量PCR检测的特异性引物序列包括：
[0016]引物Rhodopsin
‑
F的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，引物Rhodopsin
‑
R的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，TM 60℃；引物β
‑
actin
‑
F的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，引物β
‑
actin
‑
R的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，TM 60℃。
[0017]进一步，步骤二中的cDNA第一链的合成包括：
[0018](1)去除样本中的基因组DNA
[0019]将RNA、含MgCl2的10
×
反应缓冲液、不含RNase的DNaseI以及无核酸酶水加入到无RNase的反应管中，在37℃下孵育30min；加入1μL 50Mm EDTA，并在65℃下孵育10min，使用制备好的RNA作为反转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，其特征在于，检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法包括：设计秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达量的实时定量PCR检测引物组，包括符合荧光反应特点的Rhodopsin基因引物对以及β
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actin引物对；从待测秦岭细鳞鲑样品中提取得到纯化的总RNA；以待测秦岭细鳞鲑样品总RNA为模板合成cDNA第一链；以待测秦岭细鳞鲑样品总cDNA为模板，加入秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达量的实时定量PCR检测引物组，以β
‑
actin为内参，利用LightCycle 96荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测；根据LightCycler 96SW 1.1软件的定量结果，以β
‑
actin作为参照基因，采用2
‑
ΔΔCt
法计算秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因的相对表达水平。2.如权利要求1所述的检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，其特征在于，计算秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因的相对表达水平包括：求出每个待测秦岭细鳞鲑样品的目的基因Ct值和内参基因的Ct值的差值并进行单因素分差分析，差值的结果用于反应基因表达水平；再找出差值最大的时期设为对照组，计算得到不同时期之间的相对表达量。3.如权利要求1所述的检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，其特征在于，检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法包括以下步骤：步骤一，引物设计与合成：根据基因克隆得到的秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因序列，使用Premier 5.0软件设计适用于荧光定量PCR检测的特异性引物；步骤二，RNA提取及cDNA合成：提取秦岭细鳞鲑样品RNA，以RNA为模板，利用RevertAid反转录预混液试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链；步骤三，荧光定量PCR反应：配制实时荧光PCR反应体系并设置实时荧光定量PCR反应程序后进行实时荧光PCR反应，再进行数据处理及分析。4.如权利要求3所述的检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，其特征在于，步骤一中，内参基因β
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actin根据转录组uni
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gene结果设计引物，适用于秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因荧光定量PCR检测的特异性引物序列包括：引物Rhodopsin
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F的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，引物Rhodopsin
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R的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，TM 60℃；引物β
‑
actin
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F的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，引物β
‑
actin
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R的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，TM 60℃。5.如权利要求3所述的检测秦岭细鳞鲑Rhodopsin基因表达的方法，其特征在于，步骤二中的cDNA第一链的合成包括：(1)去除样本中的基因组DNA将RNA、含MgCl2的10
×
反应缓冲液、不含RNase的DNaseI以及无核酸酶水加入到无RNase的反应管中，在37...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭星辰，邵俭，熊冬梅，王艺舟，王桢璐，龚婷，叶欢，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：