本发明专利技术涉及一种从奶牛血液中分离出的具有抗菌活性的抗菌肽及其编码序列和用途。所述抗菌肽具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中１至２５位的氨基酸序列。该抗菌肽除具有一般抗菌肽抗菌谱广、杀菌快速、高度的选择性、不产生耐药性、无致畸作用的共性之外，还具有下列特点：（１）结构简单、人工合成方便，应用于哺乳动物无抗原性；（２）本发明专利技术抗菌肽分离于奶牛血液的红细胞，而红细胞为动物血液成分之一，参与血液循环过程，不存在溶血毒性，或溶血率值极低。该抗菌肽可用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染的药物，还可应用于牛奶保鲜或其它食品防腐剂及饲料防霉剂等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种从奶牛血液中分离出的具有抗菌 活性的抗菌肽及其编码序列和用途。
技术介绍
抗菌肽(antimicrobial peptides)是生物细胞基因编码产生的一类具有抗菌活 性的多肽，是机体在生物进化过程中为适应环境与自身生存而产生的天然免疫 活性分子，是天然免疫的重要介质。抗菌肽分子量小，肽链一般为10 50个氨 基酸残基。目前发现抗菌肽除了具有广谱的抗菌(革兰阳性菌和革兰阴性菌) 活性外，还对真菌(如白色念珠菌等)、病毒(如流感病毒、艾滋病病毒等)、 寄生虫(如线虫、鞭毛虫等)及肿瘤等具有极强的杀灭能力，更为重要的是抗 菌肽对正常的真核细胞几乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核 细胞，同时无免疫原性，不会产生过敏反应。抗菌肽的杀菌机理与抗生素完全 不同，抗菌肽一般是通过作用于靶细胞的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现 象，导致细菌细胞质膜通透性增大，引起胞内水溶性物质大量渗出而达到广谱 抗菌的效果。因此，病原菌对抗菌肽一般不会产生耐药性。目前，在治疗细菌性疾病是主要依赖于抗生素，抗生素的使用为人类解除 细菌性感染发挥了巨大的作用。但是，由于长期滥用抗生素，细菌耐药性越来 越强，耐药菌株感染病例越来越多，不仅使得许多曾经高度有效的抗生素药物 失效，而且对人类生命健康构成了严重的威胁。当前，对病毒性疾病主要依赖 于疫苗接种，但发病后几乎无药可治；对寄生虫性疾病基本不治疗或不预防。每年由此造成的经济损失相当巨大。抗菌肽和小分子化学抗生素相比有以下特点(1)高效性，对病原生物最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为0.25 4(ig/L; (2)广谱性，对细菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤细胞均具有作用；(3)低毒性，由 于人类与哺乳动物的正常细胞结构与病原生物和肿瘤细胞的不同，抗菌肽在起 作用的浓度范围内，对正常机体组织细胞的毒性很小；(4)稳定性，经10(TC 处理30 min或用pH值远偏离中性、较大离子强度的溶液处理后仍可保留生物活 性。某些多肽能在溶液中形成多聚体结构或与细胞膜脂质结合，获得抵抗蛋白 酶水解的能力；(5)迅速的杀菌能力，在体外实验中，大多数抗菌肽在有效MIC 的条件下，5min即能杀死99.7。/。的病原体；(6)抗菌肽还具有提高机体免疫系 统功能、提高饲料转化率、促进动物生产等功能。抗菌肽对食品中的多种革兰氏阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，能快 速抑制微生物的生长，人、畜食后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用，在 酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性，是一种极具发展前景的新 型食品防腐剂；抗菌肽还能在发酵过程中定向培养或杀死某些菌种，或在食物 中定向保存有益菌群(如乳酸菌)和防止有害菌群异常发酵。大多数活性肽还 具有良好的溶解性、热稳定性以及在高浓度状态下呈低黏度等加工特性，如大 豆多肽、菜籽多肽等，可添加到食品中，制作各种功能食品，且仍能保持原有 的生理活性，也可以直接制成口服剂型药品、保健品、营养品等。在动物饲料 抗菌肽添加剂研究方面，可用基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂，以减少 或避免抗生素添加剂引发的负面问题。抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠 道的微生态平衡，并易在动物体内残留，严重影响了畜产品的品质和人类的健 康。抗菌肽具有独特的抗菌机制及广谱而不产生耐药性的优越性质，它的出现为人们寻找理想的抗菌药物和食品添加剂提供了新的方向，为人类战胜耐药微 生物带来了新的契机，抗菌肽也因此具有巨大的应用潜力。自从世界上第一个抗菌肽天蚕素(cecr叩in)被发现以来，迄今已从生物界 分离到750多种抗菌肽，它们的分布极其广泛，从哺乳动物、甲壳动物、鱼类、 昆虫、两栖动物、鸟类到植物、细菌和病毒等均有发现。目前，国内有较多的 学者从不同陆生动物和水生动物体内分离到一些具有活性的抗菌肽。而在哺乳 动物中发现的抗菌肽主要有三类，分别是防御素、cathelicidins和histatinst23。防 御素根据氨基酸的数量、半胱氨酸的位置以及二硫键连接方式的不同，可分为a-防御素、P-防御素和e-防御素三类a-防御素是美国Lehrer实验室从兔肺巨噬细 胞中首先分离得到的阳离子性极强的小分子抗菌肽，主要存在于哺乳动物中性 粒细胞、巨噬细胞和动物小肠的Paneth细胞内；P-防御素首先在牛的气管黏膜上 皮细胞中发现，大小约38 42个氨基酸残基，由三个二硫键连接形成的P-折叠结 构，三个二硫键的位点分别是1和5、 2和4; 3和6，主要存在于哺乳动物的皮肤、黏膜等上皮细胞中；e-防御素是从猕猴的白细胞中分离出来的一种成环状结构的新型防御素，由18个氨基酸组成。cathelicidins是哺乳动物中另一大类抗菌肽， 最初是从猪的白细胞中分离到的。这类肽以没有活性的前体形式贮存于中性粒 细胞的分泌颗粒中，受到细胞刺激通过蛋白水解而释放，广泛存在于猪、羊、 马、牛、豚鼠、兔子和山羊的嗜中性细胞中。哺乳动物抗菌肽的另一个家族是 histatins，是从人的唾液中分离出的一组富含组氨酸的小的阳离子肽，相对分子 质量为3000 4000。它们具有杀真菌和细菌的活性，目前仅发现于人类和旧大 陆猴(Macaca fascicularis)中。抗菌肽对哺乳动物正常细胞一般无损伤，但是大多数抗茵肽在高浓度下(少 数抗茵肽甚至在低浓度下)有溶血作用，因而对哺乳动物正常细胞也有一定毒 性。溶血作用与疏水残基含量有关，肽分子中疏水残基含量越高则往往溶血作用越强，抗菌肽溶血活性的存在是阻碍其应用的重要因素，今后的研究要保证 抗菌肽抗菌活性的基础上消除其溶血活性，才能够真正促进抗菌肽在医药、食 品等方面的应用推广。目前，尚未见到从奶牛血液血红蛋白内进行抗菌肽的分离鉴定的研究报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种从奶牛血液中分离出的具有抗革兰阳 性细菌、革兰阴性细菌及病原真菌活性的抗菌肽，测定了其氨基酸序列，并给 出了该抗菌肽分离提纯方法，且指明了其用途。一种奶牛血液中分离出的抗菌肽，具有下述氨基酸序列Asn-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Leu-Gin-Ala-Asp-Phe-Gin-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asn-Ala-Leu-Ala-His-Lys，其分子量为2668.03，等电点pi为 7. 15。所述抗菌多肽的制备方法如下(1) 血液的采集与处理无菌条件下收集健康奶牛的血液于含肝素的试管 中，立即用0.9%的灭菌生理盐水洗涤红细胞2 4次，再用0. 83%氯化铵溶液溶 解红细胞，于4。C下离心去除白细胞后，将含血红素多肽的溶液经冻干后再用 0.01%乙酸溶解；(2) 抗菌肽的纯化将粗提的血红素溶液通过离子交换柱，阳离子复合物 结合阴离子树脂上，以25rnM乙酸铵溶液洗去非阳离子分子，再以10%乙酸溶液 洗脱阳离子分子，并收集该洗脱液，将收集的洗脱溶液以20mL/h的速率倒入阳 离子交换柱子中，用双光束紫外可见分光光度计在波长为230nm处监测其吸光 度，收集洗脱峰，冻干，以0.01%乙酸重悬，在反相高效液相色谱上以梯度化的 30 35%乙腈本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种奶牛血液中分离出的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有下述氨基酸序列： Ａｓｎ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ， 其分子量为２６６８．０３，等电点ｐＩ为７．１５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡建和，刘兴友，赵坤，王三虎，王自良，杭柏林，陈俊杰，王丽荣，杨理，王青，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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