本发明专利技术提供一种基于聚灿烂甲酚蓝碳纳米管复合电极的乙醇脱氢酶传感器，表示为乙醇脱氢酶／聚灿烂甲酚蓝／单壁碳纳米管／玻碳电极（ＡＤＨ／ＰＢＣＢ／ＳＷＣＮＴ／ＧＣＥ），即用恒电位一步法制备聚灿烂甲酚蓝／单壁碳纳米管修饰电极，电位控制在＋０．９Ｖ，时间６０ｓ～９０ｓ，再用０．２％～０．４％（Ｗ％）多糖水凝胶在电极表面固定乙醇脱氢酶，用恒电位法制备了聚灿烂甲酚蓝／碳纳米管纳米复合物修饰玻碳电极，该电极检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤＨ），方法简便，且线性宽、响应快、灵敏度高、检出限低，重现性好、稳定和抗干扰等优异性能。将乙醇脱氢酶用多糖水凝胶固定在聚灿烂甲酚蓝／碳纳米管纳米复合物修饰玻碳电极表面，制备脱氢酶传感器，保持高酶活性，具有高稳定性和良好的重现性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乙醇脱氢酶传感器，尤其是涉及用聚灿烂甲酚蓝和碳纳米管复合电极，以及乙醇脱氢酶的固定化制备方法。
技术介绍
生物体中绝大多数氧化还原反应都是在脱氢酶或氧化酶的催化下进行，其中脱氢 酶尤为重要。脱氢酶作为生物体内的大分子是构成生命的主要基元，参与完成生命体中的 新陈代谢等许多生理过程，在这些生命过程中，脱氢酶都要经历电子转移过程，在其氧化型 和还原型之间相互转化。研究生物体中的电子传递过程能揭示生命过程的奥秘。脱氢酶的 电化学研究是生物电化学界和生物学界非常关注的研究问题。它的研究对于深入认识酶在 生命体内的生理作用及电子传递反应传递机制以及开发新型生物传感器、新型生物燃料电 池等生物电子器件具有重要的理论和应用指导意义。基于生物识别的高度专一性与电化学信号检测的放大作用相结合的电化学生物 传感器，具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化等优点，在生物分析和环境检测等 领域应用广泛。早在20世纪60年代，生物催化功能就已被用于电化学生物传感器的研制。 但主要使用氧化酶作为生物敏感材料，如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶等，通过检测氧化酶催 化的生物反应中消耗的氧气或产生过氧化氢，可以间接测定底物的含量(第一代电化学生 物传感器)；或者使用电子媒介体，改变催化反应的路径，达到测定底物的目的(第二代电 化学传感器)，如目前市场上大多数血糖仪就是采用电化学测定葡萄糖氧化酶反应过程中 产生的电流，而得出血糖值。采用葡萄糖氧化酶的血糖仪在测定血糖值时，氧的影响是不可避免的，因为在电 子向电极转移时氧与介质竞争，高浓度氧可导致血糖值信号偏低，而低浓度氧则可导致血 糖值信号偏高。正像电化学干扰因素一样，氧的影响在低糖时最明显，这一影响通常太明 显，以至这些试纸不能用于所有来源的血样(静脉、毛细血管和动脉血)的测定。采用葡萄 糖脱氢酶作为葡萄糖反应的酶，可避免这一问题。与葡萄糖氧化酶不同，葡萄糖脱氢酶反应 过程不需氧的参与，氧的影响大大降低，稳定性更高，测试结果更准确。因此，用电化学方法 研究脱氢酶的氧化还原反应，为构筑脱氢酶生物传感器提供理论和实验基础，具有广阔的 应用价值和前景。脱氢酶反应过程虽然不需氧的参与，但需要NAD (P)作为辅基参与电子的传递。令 人遗憾的是NAD-NADH在电极上的氧化还原行为是不可逆的，NAD进行电化学还原不能得到 NADH，而是产生一种二聚物。NADH经电化学氧化生成NAD，但过电位较大，NADH在玻碳电极 上于+0. 75V的电位下再循环利用，电位明显高于其标准电位-0. 32V。因此降低NADH的氧 化过电位，对NADH高效的催化氧化，是构建电化学脱氢酶生物传感器的先决条件。将染料 如亚甲蓝、硫堇、亚甲绿和灿烂甲酚蓝等固定在电极表面，研制成对NADH有良好催化活性 的仿生界面，降低NADH氧化过电位可达500-600mV。固定的方法有吸附法，现场电化学聚 合法及自组装膜法等。吸附型仿生界面的最大缺点是不稳定；现场电化学聚合法中酶的损耗较多；自组装膜法耗费时间较长。因此研究酶及媒介体的固定方法是解决传感器稳定性 的关键。纳米粒子具有独特的化学性质和物理性质，如表面效应、微尺寸效应、量子效应和 宏观量子隧道效应等，纳米技术引入生物传感器领域后，提高了生物传感器的检测性能，并 促发了新型的生物传感器。因为具有了亚微米的尺寸、换能器、探针或者纳米微系统，生物 传感器的化学和物理性质和其对生物分子或者细胞的检测灵敏度大幅提高，检测的反应时 间也得以缩短，并且可以实现高通量的实时检测分析。纳米技术构筑脱氢酶生物传感器，已有一些报道，如瑞典Gorto n教授的课题组进 行了系统的研究。我国中科院长春应化所、南京大学、南京师范大学的一些课题组也进行了 有效的探索。其方法主要是利用碳纳米管或金纳米溶胶修饰电极，作为附载酶或媒介体的 载体，以吸附法和包埋法固定媒介体和酶，构筑脱氢酶传感器。这些研究为构筑脱氢酶生物 传感器提供了新的思路和方法。构筑脱氢酶电化学传感器，需要解决的问题还很多，如选择 合适的纳米材料和适宜的纳米技术构筑纳米仿生界面，NADH有效的循环再利用，选择合适 的媒介体，选择合适的固定化材料和方法以保持酶的活性等等。利用聚灿烂甲酚蓝催化氧化NADH，有一些报道，但大多采用循环伏安法在玻碳电 极表面制备聚灿烂甲酚蓝。制备聚灿烂甲酚蓝/碳纳米管修饰电极及构筑乙醇脱氢酶传感 器还未见报道。
技术实现思路
本专利技术涉及一种乙醇脱氢酶传感器，尤其是涉及用聚灿烂甲酚蓝和碳纳米管复合 电极，固定化乙醇脱氢酶等制备方法。乙醇脱氢酶电化学传感器，其特征在于表示为乙醇脱氢酶/聚灿烂甲酚蓝/单壁 碳纳米管/玻碳电极(ADH/PBCB/SWCNT/GCE)。.乙醇脱氢酶电化学传感器的制备步骤如下a)将市售单壁碳纳米管经混酸恒温40°C超声分散成均勻的黑色溶胶，抽虑纯化， 清洗，真空干燥，制得单壁碳纳米管水溶液。滴涂2 μ L 10 μ L单壁碳纳米管水溶液至洁 净的玻碳电极表面，室温干燥，制得单壁碳纳米管修饰电极。b)将此电极放入灿烂甲酚蓝溶液中，采用三电极系统，硝酸钾为支持电解质，磷酸 缓冲溶液调节PH值，控制电位极化，取出电极，清洗，制得聚灿烂甲酚蓝/单壁碳纳米管修 饰电极。c)取多糖水凝胶溶液，加入少许有机小分子，再加入乙醇脱氢酶，制得酶溶胶。取 10 μ L酶溶胶滴涂于灿烂甲酚蓝/单壁碳纳米管修饰电极表面，4°C下干燥，制得乙醇脱氢 酶传感器。步骤⑵中，所述的溶液pH值为8. 0，控制电位为+0. 9V，极化时间为60s 90s。步骤(3)中，多糖水凝胶溶液使用卡拉胶、琼脂糖、海藻酸钠、甲基纤维素等中的 一种，浓度为 0. 2% 0. 8% (W/W)。步骤(3)中，有小分子为二甲亚砜，二甲基甲酰胺，甘油等中的一种，加入量为多 糖水凝胶有机不分子=3 1 (V/V)。本专利技术的有益效果体现在用恒电位法制备了聚灿烂甲酚蓝/碳纳米管纳米复合物修饰玻碳电极，此方法具有简便、快速、高效的特点。用多糖水凝胶固定化酶于电极表面， 多糖水凝胶具有较强的弹性、高稳定性和良好的生物亲和性，是固定酶的理想生物聚合物； 多糖水凝胶在各种有机溶剂中很稳定；多糖水凝胶具有一定的孔径，底物分子能自由扩散 至琼脂糖凝胶中，与固定化的蛋白质酶作用；多糖水凝胶呈网状结构，其中形成许多水腔， 为酶提供适宜的微水环境；保持酶的原始构象和生物活性。在制备多糖水凝胶时，要注意多 糖的浓度合适，控制加热温度。在水凝胶中加入有机小分子，加速了多糖水凝胶的凝胶化过 程，形成均勻和稳定的水凝胶，能将蛋白质牢固地固定在电极表面，增加酶传感器的使用寿 命。制得的聚灿烂甲酚蓝/单壁碳纳米管修饰电极用于检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，具有 方法简便，且线性宽(3. O 104. 2 μ M)、响应快(< 5s)、灵敏度高(9. 884ηΑ/μ M)、检出限 低(1. 0 μ Μ, S/N = 3)，重现性好、稳定和抗干扰等优异性能。 制得的乙醇脱氢酶传感器用于乙醇的检测，乙醇浓度范围0. 4 2. 4mM内，有线性 关系，检出限为0. ImM(S/N = 3)，具有酶的高活性(米氏常数为2. 3mM)、稳定性高和良好的 重现性。附图说明下面本文档来自技高网...
【技术保护点】
乙醇脱氢酶电化学传感器，其特征在于：表示为乙醇脱氢酶／聚灿烂甲酚蓝／单壁碳纳米管／玻碳电极（ＡＤＨ／ＰＢＣＢ／ＳＷＣＮＴ／ＧＣＥ），即用恒电位一步法制备聚灿烂甲酚蓝／单壁碳纳米管修饰电极，电位控制在＋０．９Ｖ，时间６０ｓ～９０ｓ，再用０．２％～０．４％（Ｗ％）多糖水凝胶在电极表面固定乙醇脱氢酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧宏，肖冲，杨冬伟，
申请(专利权)人：襄樊学院，
类型：发明
国别省市：42[中国|湖北]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。