人组织激肽释放酶ＥＬＩＳＡ试剂盒的制备制造技术

人组织激肽释放酶ＥＬＩＳＡ试剂盒的制备，实现本发明专利技术技术方案如下：一种人组织激肽释放酶含量测定的ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于：ａ）该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；ｂ）加入了生物素－亲和素放大系统；ｃ）标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；ｄ）其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素化的单抗；ｅ）灵敏度为０．３ｎｇ／ｍｌ－５００ｎｇ／ｍｌ。本发明专利技术试剂盒具有灵敏度高，特异性强，重复性好的特点。利用上述表达的融合蛋白最为标准品，其标准曲线的相关系数高达０．９９。采用大批量人血浆作为待测样本，其中组内差异及组间差异均低于１０％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人组织激肽释放酶融合蛋白，是一种人组织激肽释放酶含 量检测的ELISA试剂盒。
技术介绍
人组织激肽释放酶(HK1)是一类丝氨酸蛋白酶，能促进低分子激肽原释放血管 活性肽从而发挥一系列生物活性作用，命名为KLK1。在人和动物的高血压、心 血管疾病和肾脏疾病的模型中，均可见到服含量的降低。我们在转基因的动物 模型中发现HK1具有降低血压，改善胰岛素抵抗，改善肾功能的作用。HK1的 水平在人的心血管疾病及肾脏疾病的发生发展的过程中可能具有重要的预测价 值。因此，建立HK1含量测定的高效检测试剂盒在临床和科研上均有重要的意义。鉴于HK1在心血管疾病及肾脏疾病中的预测及治疗价值，国外已有KLK1的 含量测定ELISA试剂盒。其采用的方法为竞争ELISA法，所用的抗体为一种多克 隆抗体。因此，其方法复杂，计算繁琐，易于产生非特异显色而导致结果误差较 大并且价格昂贵不符合中国国情，而国内又无此类的试剂盒。针对上述存在的这 些问题专利技术人将釆用了最新的双抗体夹心ELISA技术，并加入了生物素-亲和素 系统从而简化了操作过程，提高了特异性及灵敏度。我们利用HK1的多克隆抗体 包被ELISA板，能尽可能多的捕获到服l的融合蛋白及HK1，生物素化的单克隆 抗体(生物素-HTK)能特异性地识别ELISA板上的HK1的-一段特异性的表位。因 此，我们生产的人组织激肽释放酶ELISA试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作 简便的特点，更重要的是更为经济适用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒。实现本专利技术技术方案如下一种人组织激肽释放酶含量测定的EUSA试剂盒，其特征在于a) 该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；b) 加入了生物素-亲和素放大系统；C)标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；d) 其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素 化的单抗；e) 灵敏度为0.3ng/ml-500ng/m。人组织激肽释放酶含量测定的ELISA试剂盒的方法，其特征在于包括如下 步骤a) 1: 6400倍稀释的包被抗体包被ELISA板，并置于4"C孵育24小时；b) 1XBSA封闭1小时；c) 倍比稀释标准品，并分别加入标准品及1:10倍稀释的样品，于37"C反 应60分钟；d) 加入1:800倍稀释的检测抗体并于37。C孵育40分钟；e) 加入l: 2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素25分钟。f) TMB显色并读数。特异性人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被反应板的制备方法，通过下列步骤制备而成1)人组织激肽释放酶融合蛋白的获得a.人组织及肽释放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表达以pcDNA-服为模板， 用特异性引物PCR扩增KLK1目的基因，目的基因克隆于PEGX-4T1原核表达载体，转化DH5a感受态细菌。根据氨苄青霉素抗性提取克隆，提取转化子的质粒DNA, 鉴定，得到与目的片段相一致的片段，判为阳性结果。将目的基因的重组质粒 HK/4T1转化大肠杆菌DH5 a ,经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考 马斯亮蓝染色显示，大约在55KD处有一条浓染的新增蛋白条带。经Western bloting鉴定，能与人组织激肽释放酶单克隆抗体发生强阳性反应，HK-4T1融 合蛋白具有较强的免疫原性。b.HK-4T1融合蛋白的大量表达、纯化经过大量诱导，表达，包涵体纯化 得到大量的HK-4T1融合蛋白。2) 抗服-4T1融合蛋白多克隆抗体的制备将纯化的融合蛋白与弗氏完全佐 剂充分乳化后免疫家兔获得多克隆抗体，经亲和层析纯化作为包被抗体。3) 用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将包被抗体稀释成适宜浓度后，在每个 酶标板的反应孔中加入0.1ml， 4"C过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗3次， 每次3分钟，然后拍干；得到人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗体包被酶标板。4) 每孔加入200ull。/。BSA-PBS， 4。C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液 洗3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到人组织激肽释放酶融合蛋白多克隆抗 体包被反应板。这种人组织激肽释放酶含量检测的ELISA试剂盒，其特征在于所述试剂盒 由上述特异性抗人组织及肽释放酶多克隆抗体包被板、标本稀释液、洗涤液、 标准品、生物素化二抗、酶标亲和素、显色液、终止液构成。具体分为(l)洗涤液含0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST); (2)标本稀释液含BBSA 的磷酸盐缓冲液(PBS); (3)标准品上述人组织激肽释放酶融合蛋白 HK-4T1; (4)生物素化二抗生物素标记的人组织及肽释放酶单克隆抗体；(5)酶标亲和素辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Str印tavidin/服P); (6)显色液TMB(四甲基联苯胺)使用液；(7)终止液2M H 2 SO 4溶液。本专利技术试剂盒具有灵敏度高，特异性强，重复性好的特点。利用上述表达的融合蛋白最为标准品，其标准曲线的相关系数高达0.99。采用大批量人血浆作为 待测样本，其中组内差异及组间差异均低于10%。附图说明图1为人组织激肽释放酶融合蛋白HK-4T1的SDS-PAGE。 图2为抗HK-4T1重组蛋白多克隆抗体的SDS-PAGE。 图3为人组织激肽释放酶融合蛋白的Western bloting。 图4为抗HK-4T1重组蛋白多克隆抗体的Western bloting。 图5为该ELISA试剂盒的标准曲线。具体实施例方式以下实例用来说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 实施例1人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备 l.试剂(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液) Na2C0 3 1.59克NaHCO 3 2.93克 加蒸馏水至1000ml;(2) 洗涤缓冲液(PH7.4PBS): 0.15M KH2P04 0.2克 Na2HP0 4-12H20 2.9克 NaCl 8.0克KC1 0.2克Tween-20 0.1% 0.5ml加蒸馏水至1000ml;(3)标本稀释液牛血清白蛋白(BSA)O.l克加洗涤缓冲液至100ml;(勺标准品人组织激肽释放酶融合蛋白，为本实验时自产；(5) 生物素化二抗生物素标记的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，为本实验室自产；(6酶标亲和素HRP标记链霉亲和素，为武汉博士德生物有限公司生产；(7) 终止液(2M H2S04):蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98X)21.7ml。(8) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸)0.2M Na 2 HPO 4 (28.4克/ L) 25.7ml0.1M柠檬酸(19.2克/ L) 24.3ml加蒸馏水50ml。(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液TMB(10mg / 5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75%H2O2 32pl2.主要仪器(1) 酶标仪ELX800 Universal Microplate reader(2) EUSA反应板Corning incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate3.方法酶标亲和素抗最适浓度的选择(1) 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人组织激肽释放酶含量测定的ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于：　　ａ）该试剂盒采用的方法为双抗体夹心法；　　ｂ）加入了生物素－亲和素放大系统；　　ｃ）标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶；　　ｄ）其包被抗体为抗人组织激肽释放酶的多克隆抗体，检测抗体为其生物素化的单抗；　　ｅ）灵敏度为０．３ｎｇ／ｍｌ－５００ｎｇ／ｍｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪道文，张琴，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]