本发明专利技术公开了一种检测牛腺病毒３型的荧光定量ＰＣＲ试剂盒及应用，该试剂盒含有：ａ）ＤＮＡ提取试剂，ｂ）热启动Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ｃ）引物和ＴａｑＭａｎ探针，ｄ）标准阳性ＤＮＡ模板，ｅ）ＰＣＲ荧光定量反应液，其特征是：引物序列分别为正义引物：５′－ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡ－３′，反义引物：５′－ＣＣＴＡＣＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＣＡＧＡＴ－３′，扩增子大小为１００ｂｐ，荧光探针序列为：５′－ＦＡＭ－ＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＡ－ＴＡＭＲＡ－３′，探针的５′端标记荧光发射基团ＦＡＭ，靠近３′端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入腺病毒３型ｐｏｌ蛋白１００ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测Ａ↓［２６０］定量并１０倍梯度稀释。高效方便地对血清制品中的牛腺病毒３型污染进行实时监控，可广泛用于该病毒感染的流行病学调查，还能为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，涉及一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试 剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，适用于对血清制品中的牛腺病 毒3型污染进行实时监控，同时广泛用于该病毒感染的流行病学调査，还可以为 相关基础研究提供技术支持。
技术介绍
牛腺病毒3型属于腺病毒属腺病毒科，基因组是双链的DNA分子，主要引 起牛的呼吸道和肠道疾病。其主要特征为肺炎、肠炎、结膜炎和多发性关节炎， 是犊牛死亡的重要原因之一，病和隐性感染的牛均可排毒，并能使与其接触的易 感牛感染。其易感和潜伏性给畜牧业及其国际贸易带来严重的经济损失。因此， 该病历来都是国际社会最为关注的传染病之一。牛腺病毒的快速检测是控制和消 灭该病的前提，但腺病毒的常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有 血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类1. 血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、 沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光技术、放射免疫试验和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍承认、采用并且广泛应用的有补体结合实验、间接血凝实验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应， 反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。2. 生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高， 周期长，浪费生物资源和人力物力。3. 分子生物学诊断技术包括核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图 谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳 等检测方法更适用于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高，不适宜同时迸行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下， 普通PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接 检测灭活的核酸片段。样品可以是牛血清，也可以是扁桃体、淋巴结、脊髓、肌 肉和皮肤等组织，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都 是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板 量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。 因此，如何快速、准确测定牛腺病毒是面临的主要难题之一。近年来发展起来的荧光定量PCR (Fluorogenetic Quantitative PCR， FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM， Dalgaard M， et al, Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology. Toxicology, 2001， 163:29-38)、病原体的定性 (McGoldrick A, Lowings JP, Ibata G， et al. A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Vims by RT-PCR with a Fluorogenic Probe (TaqMan) . J. Virol. Methods,1998， 72:125-135.; Bhudevi B， Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus . Vet. Microbiol. , 2001, 83:1-10.)和定量检测(Kathy F丄Tang,Jun Wang, Donald V丄ightner. Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay . J. Virol. Methods, 115(2004) 109-114.;Michaela Schwaiger, Pascal Cassinotti. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA . J. Clin. Microbiol" 27(2003) 136-145.;R.Frank Cook"， S丄Cooka, et al. Development of a multiplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction for equine infectious anemia virus(EIAN) .丄Virol. Methods, 105(2002) 171-179.; Birgit Liss* . Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells . Nucleic Acids Res" 2002，Vol.30 No.17 e89.;Franck Housseau al imberly R丄indsey a,1， et al. Quantitative real-time RT陽PCR as a method for monitoring T lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase protein in vaccinated melanoma patients . J. Immunol. Methods 266(2002) 87-103.; Desire N， Dehee A， Schneider V， et al, Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay . J. Clin. Microbiol, 2001, 39:1303-1310.; Martell M， Gomez J, Esteban JI, et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA . J. Clin. Microbiol, 1999, 37:327-332.; Kearns AM, Turner AJL, Eltringham GJA， et al. Rapid Detection and Quantif本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牛腺病毒３型的荧光定量ＰＣＲ试剂盒，该试剂盒含有：ａ）ＤＮＡ提取试剂，ｂ）热启动Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ｃ）引物和ＴａｑＭａｎ探针，ｄ）标准阳性ＤＮＡ模板，ｅ）ＰＣＲ荧光定量反应液，其特征是：引物序列分别为正义引物：５′－ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡ－３′，反义引物：５′－ＣＣＴＡＣＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＣＡＧＡＴ－３′，扩增子大小为１００ｂｐ，荧光探针序列为：５′－ＦＡＭ－ＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＡ－ＴＡＭＲＡ－３′，探针的５′端标记荧光发射基团ＦＡＭ，３′端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入腺病毒３型ｐｏｌ蛋白１００ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测Ａ２６０定量并１０倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑从义，郭佳，张国荣，
申请(专利权)人：武汉三利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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