一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于同时检测禽流感病毒血凝素主要亚型的LAMP引物组合及其应用，属于生物技术领域。能鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型。禽流感病毒每种亚型的引物包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB。本发明专利技术可用于鉴别诊断区分引起鸡发热、腹泻、产蛋下降甚至高病死率的禽流感病毒的亚型。本发明专利技术提供的引物组合物检测引起鸡发热、腹泻、产蛋下降甚至高病死率的禽流感病毒血凝素亚型具有灵敏性、特异性高、稳定性高、用时短等特点。稳定性高、用时短等特点。稳定性高、用时短等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物及应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物及应用。

技术介绍

[0002]禽流感是危害当前养鸡生产的重要疫病，既包括高致病性禽流感，还包括中低致病性禽流感，前者属于我国一类动物疫病，其病原就是禽流感病毒(Avian influenzavirus，AIV)属于正粘病毒科，其基因组为单股正链RNA。AIV的天然宿主包括鸡、火鸡、水禽及迁徙鸟等多种禽类，可引起发热、呼吸道症状、腹泻、产蛋鸡产蛋下降，高致病性禽流感病毒则还引起高病死率等。禽流感的主要传播途径是呼吸道和消化道，鸡最易感，各种年龄的鸡都易感染，虽然实施了普遍免疫接种预防措施，但每年都引起不少鸡的呼吸道疾病与死亡、产蛋产蛋下降，造成严重的经济损失。AIV容易变异，按照血凝素抗原(HA)可分为多种血清亚型，但当前流行最具有优势的则是H5、H7、H9三种亚型，所有的高致病性毒株都属于H5、H7亚型，但不是所有的H5、H7亚型都是高致病性毒株，H9则不属于高致病性毒株。虽然实施了普遍免疫接种预防措施，但免疫效果并不太理想，每年都引起不少蛋鸡发生禽流感疫情，造成严重的经济损失。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种用于检测禽流感病毒HA亚型的引物组合物及应用。具体通过以下技术方案实现：
[0004]所述用于检测禽流感病毒H5亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：
[0005][0006]所述用于检测禽流感病毒H7亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：
[0007][0008]所述用于检测禽流感病毒H9亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：
[0009][0010]所述的引物还包括将上述各F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。
[0011]本专利技术提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型基因的应用。
[0012]所述的引物组合物在环介导等温扩增(LAMP)方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4
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16：4
‑
16：2
‑
8：2
‑
8范围。
[0013]所述的环介导等温扩增反应条件为60
‑
65℃范围。
[0014]本专利技术还提供了上述组合物在用于禽流感病毒HA亚型基因检测的试剂盒或芯片中的应用，具体为：
[0015]在制备检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型基因试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
[0016]所述的试剂盒或芯片的检测步骤包括：
[0017]1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组或RNA，并对RNA反转录成cDNA。
[0018]2)以步骤1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行对禽流感病毒H5、H7、H9亚型基因的环介导等温扩增。
[0019]本专利技术所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有禽流感病毒H5、H7、H9亚型基因。
[0020]应用上述引物组合物可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有禽流感病毒H5、H7、H9亚型；如果不可以对样品中基因cDNA模版特异性扩增，则待测样品中不含有禽流感病毒H5、H7、H9亚型。
[0021]本专利技术提供的用于检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型基因的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言，能够在1小时内获得检测结果。
附图说明
[0022]图1、AIV
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H5引物扩增典型荧光曲线(AIV
‑
H5扩增S形曲线，AIV
‑
H7、AIV
‑
H9和鸡基因组扩增曲线近乎直线)；
[0023]图2、AIV
‑
H7扩增典型荧光曲线(AIV
‑
H7扩增S形曲线，AIV
‑
H5、AIV
‑
H9和鸡基因组扩增曲线近乎直线)；
[0024]图3、AIV
‑
H9引物扩增典型荧光曲线(AIV
‑
H9扩增S形曲线，AIV
‑
H5、AIV
‑
H7和鸡基因组扩增曲线近乎直线)；
[0025]图4、100拷贝AIV
‑
H5、AIV
‑
H7、AIV
‑
H9人工质粒和鸡基因组扩增曲线。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法；
[0028]实施例1
[0029]分别人工合成AIV
‑
H5基因、AIV
‑
H7基因、AIV
‑
H9基因。
[0030]使用RNAfast 200总RNA抽提试剂盒分别提取AIV
‑
H5、AIV
‑
H7、AIV
‑
H9基因组，然后分别加入反转录体系，42℃水浴1h。随后70℃水浴10min，冰浴5min，得到AIV
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H5、AIV
‑
H7、AIV
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H9的cDNA。
[0031]使用EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒提取鸡基因组。即为PCR反应的模板。
[0032]实施例2
[0033]将AIV
‑
H5、AIV
‑
H7、AIV
‑
H9基因组和鸡基因组用作模板，反应体系如下表；
[0034]禽流感病毒荧光LAMP反应
[0035]采用25μL反应体系：
[0036][0037]禽流感病毒H5亚型各引物的核苷酸序列如下：
[0038]F3：GTTGTTTCGAGTTCTATCACAAB3：ATTGCCAGTGCTAGGGAAFIP：TCTGAGTACTGGGGGTAGTCAGTGATAATGAATGTATGGGAAGTBIP：AAGGGAAGAAATAAGCGGAGTGGCCACTGTAGAATAAATTGACAGLF：TACGTCCCATTTCTCACLB：GGAATCAATAGGAACTTAC
[0039]结果如图1所示，AIV
‑
H5荧光曲线为特异S型曲线，AIV
‑
H7与AI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物用于检测禽流感病毒H5亚型HA基因、H7亚型HA基因、H9亚型HA基因；所述用于检测禽流感病毒H5亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：所述用于检测禽流感病毒H7亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：所述用于检测禽流感病毒H7亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：所述用于检测禽流感病毒H9亚型HA基因的引物组合物，包括以下引物：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物，其特征在于，所述的组合物包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。3.根据权利要求1所述一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物，其特征在于，在环介导等温扩增方法中用以检测禽流感病毒H5亚型基因、H7亚型基因、H9亚型基因。4.根据权利要求3所述一种用于检测禽流感病毒HA亚型基因的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物在环介导等温扩增方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：周维依，
申请(专利权)人：北京芯之悦生物技术中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：