一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂及其制备方法和应用，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP

【技术实现步骤摘要】
一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种子宫内膜癌的检测方法，具体涉及一种基于血清寡糖链G
‑
Test特异指纹图谱的子宫内膜癌检测方法。

技术介绍

[0002]子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，又称子宫体癌，是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一，多发生于围绝经期及绝经后妇女。随着人口平均寿命的增加以及生活习惯的改变，子宫内膜癌的发病率近二十年呈持续上升和年轻化趋势。作为继宫颈癌之后第二常见的妇科恶性肿瘤，约占妇科恶性肿瘤的20％～30％。部分发达城市的子宫内膜癌发病率已达妇科恶性肿瘤第一位。根据发病机制和生物学行为特点将子宫内膜癌分为雌激素依赖型(Ⅰ型)和非雌激素依赖型(Ⅱ型)。雌激素依赖型子宫内膜癌大部分病理类型为子宫内膜样腺癌，少部分为黏液腺癌；非雌激素依赖型子宫内膜癌病理类型包括浆液性癌、透明细胞癌、癌肉瘤等。在子宫内膜癌早期，多数患者没有明显的相关阳性体征。因多数患者合并糖尿病、高血压或心血管疾病，因此应关注相关系统体征。晚期患者可触及下腹部增大的子宫，出现贫血、消瘦、发热、恶病质等全身衰竭表现。
[0003]子宫内膜癌的临床诊断主要依靠组织病理学和细胞学检测、影像学检测和肿瘤标志物检测。子宫内膜的组织病理学检查及子宫外转移灶活检或手术切除组织标本，为诊断子宫内膜癌金标准，但由于是侵入式检测，患者的依从性差。影像学检查包括B超、CT、MRI作为辅助检查进行子宫内膜癌的诊断，其特异性有待进一步提高。临床上CA153、CA19
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9和CA125用于子宫内膜癌的筛查，但目前使用的这几种肿瘤标志物的敏感度都不高。上述诊断方法都有自身的局限性，目前急需探索出用于辅助诊断子宫内膜癌并具有较高灵敏度和特异度的新型无创性的方法。
[0004]糖蛋白是通过蛋白质的翻译后修饰即糖基化后形成的一类结合蛋白。蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。蛋白质上N
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糖链通过加工修饰来调控蛋白质的结构，稳定性和活性，所以糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能起重要作用，从而赋予糖蛋白具有多种生物功能。因此了解糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。
[0005]目前己经在多种肿瘤中发现了蛋白质N
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糖链的异常改变，而N
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糖链的末端唾液酸修饰改变是其中之一。唾液酸是一类带负电荷的9碳糖化合物，广泛存在于生物体内，常位于聚糖链末端；其在唾液酸酶的作用下通过α
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2,3或α
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2,6糖苷键与糖链上的半乳糖或N
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乙酰半乳糖胺连接形成聚唾液酸链。研究发现聚糖链末端的唾液酸在调控细胞的相互识别、分子相互作用、病毒感染、免疫响应以及信号传导起到重要的功能，且细胞表面糖蛋白质唾液酸修饰具有组织和细胞特异性。众多研究表明唾液酸修饰异常参与了疾病的发生发展，
且与多种疾病如感染性疾病以及肿瘤的浸润和转移有着密切关系。因此检测唾液酸相关的寡糖基的改变对于疾病的诊断和作为靶点开发治疗的药物具有潜在的临床价值。

技术实现思路

[0006]针对目前临床上使用的子宫内膜癌检测中存在的问题，如血液检查和影像学检测特异性和准确度不高，病理检查有创伤性，患者依存性差等，本专利技术提供一种子宫内膜癌检测试剂，通过该试剂测定血清中的天然寡糖N
‑
糖组图谱，通过将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种子宫内膜癌的血清天然寡糖N
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糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测子宫内膜癌。
[0007]本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂，由以下试剂组成：
[0009]试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
[0010]试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP
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40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；
[0011]试剂C：由8
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氨基芘
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1,3,6
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三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；
[0012]试剂D：终止液。
[0013]优选的，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是1:1:1。
[0014]优选的，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积都为5μl。
[0015]优选的，所述试剂D为超纯水。
[0016]一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0017]步骤一寡糖链的制备
[0018]在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂A，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂B，37℃反应3h，然后进行干燥；
[0019]步骤二寡糖链的标记
[0020]在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂C，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂D终止标记反应；
[0021]步骤三寡糖链分离分析
[0022]取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行N
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寡糖链分离检测，得到天然寡糖N
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糖组图谱；
[0023]步骤四数据处理分析
[0024]N
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糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
[0025]一种组合物在制备寡糖链子宫内膜癌检测试剂中的应用，所述组合物由血清中的G4S4、G3S3、G2S2、G2S2F、G2S1、G2S1F、G1F和G2F2组成，所述组合物通过(G2S2+G1S1F+G1F
×
G2S1F)/G3S3的值来检测子宫内膜癌。
[0026]所述G1F为同分异构体。
[0027]本专利技术提供一种子宫内膜癌的血清天然寡糖N
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糖组图谱模型的建立方法，通过测
定血清天然寡糖链G
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Test特异指纹图谱，进行统计学分析。
[0028]材料和方法：
[0029]一、检测样本：子宫内膜癌患者和健康人的血清。
[0030]二、实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
[0031]三、试剂制备：
[0032]1、试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
[0033]2、试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP
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40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；试剂C：由8
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氨基芘
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1,3,6
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三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；试剂D：终止液。2.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是1:1:1。3.根据权利要求2所述的基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积都为5μl。4.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂D为超纯水。5.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一寡...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠英，徐蕾，李维泉，张军利，傅婷婷，
申请(专利权)人：江苏先思达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：