牛精子克隆胚胎的方法技术

本发明专利技术具体涉及牛精子克隆胚胎的新方法。步骤如下：（１）将采集的牛卵巢洗后将卵丘－卵母细胞复合体抽出，体外培养，使卵母细胞培养发育至第二次减数分裂中期（２）对卵母细胞的细胞核染色和荧光定位，并去核得到去核的牛卵母细胞；（３）采集优秀种公牛的精液，或取自性控优秀种公牛的商用精液置液氮罐中贮存；（４）解冻精液并做获能处理，置于卵母细胞注射液中；（５）将两个获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；（６）将精子重构胚激活培养。本发明专利技术克服了传统核移植中供体细胞只能是体细胞单一模式，是利用双精子取代体细胞作为供体注入去核牛卵母细胞胞质内生产牛胚胎的一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
牛精子克隆胚胎的方法，其步骤包括：　（１）将采集回的牛卵巢用磷酸缓冲液洗后将卵丘－卵母细胞复合体抽出，置于成熟培养液中进行体外培养，使所述的卵母细胞培养发育至第二次减数分裂中期，用透明质酸酶对卵丘－卵母细胞复合体脱颗粒细胞处理；　 　（２）先对步骤（１）的卵母细胞的细胞核染色，置于卵母细胞去核液中，再对细胞核进行荧光定位，准确吸取所述的细胞核，得到去核的牛卵母细胞；　（３）采集同一头优秀种公牛的精液，或采集同一品种的不同个体的两头优秀种公牛的精液，或采集不同品种 的两头优秀种公牛的精液，或购买性控优秀种公牛的商用精液，将所述的种公牛精液置液氮罐中贮存备用；　（４）将所述的种公牛精液在３７℃下解冻，用精子获能液使所述的精子获能，置于卵母细胞注射液中备用；　（５）用显微操作针一次性将步骤（４ ）所述的两个获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；　（６）将步骤（５）构建好的精子重构胚用激活培养基－１和激活培养基－２进行体外人工激活，使重构胚融合，然后，将激活后的精子重构胚置于胚胎培养液中培养；　其中：　 　步骤（１）的成熟培养液组分及配比如下：　以ＴＣＭ－１９９商品培养基为基本培养基，附加胎牛血清１０％，乙基哌嗪乙磺酸２５ｍｍｏｌ，丙酮酸钠０．５５ｍｇ／ｍＬ，青霉素１００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００ＩＵ／ｍＬ，促卵泡素０．１ＩＵ／ｍＬ、促 黄体素０．１ＩＵ／ｍＬ、雌激素１μｇ／ｍＬ、表皮生长因子１００ｎｇ／ｍＬ，调ｐＨ至７．０－７．２；　步骤（１）的磷酸缓冲液组分及配比如下：氯化钠８．０ｇ／Ｌ＋氯化钾０．２ｇ／Ｌ，磷酸氢钠１．１５ｇ／Ｌ，磷酸二氢钾０．２ｇ／Ｌ，调ｐＨ至 ７．０－７．２；　步骤（２）的卵母细胞去核液：基础液为成熟培养液，添加５μｇ／ｍＬ细胞松弛素Ｂ，以重量／体积计的１０％聚乙烯吡咯烷酮；　步骤（４）的精子获能液：ＢＯ基础液＋６ｍｇ／ｍＬ牛血清白蛋白，５ｍＭ咖啡因，６０ｕｇ／ｍＬ肝 素；　步骤（５）的卵母细胞注射液：基础液为步骤（１）的成熟培养液，添加按重量／体积计的１０％聚乙烯吡咯烷酮；　步骤（６）的激活培养基－１和激活培养基－２的组分及配比如下：　激活培养基－１：　基础液为成熟培养液附加离子 霉素５μｍｏｌ／Ｌ，调ｐＨ至７．０－７．２；　激活培养基－２：　基础液为成熟培养液附加二甲基氨基嘌呤２ｍｍｏｌ／Ｌ，调ｐＨ至７...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨利国，王滇，肖遥，张鑫，霍立军，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]