麻疹载体COVID-19免疫原性组合物和疫苗制造技术

本发明专利技术涉及针对冠状病毒的免疫领域。在这方面，本发明专利技术提供了触发针对冠状病毒的免疫应答的冠状病毒衍生的载体抗原。因此，本发明专利技术涉及一种活性成分(即表达一种或多种冠状病毒抗原的活减毒重组麻疹病毒)，以及其在引发免疫，特别是针对SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】麻疹载体COVID
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19免疫原性组合物和疫苗


[0001]本专利技术涉及针对冠状病毒的免疫领域。

技术介绍

[0002]冠状病毒是具有大基因组(26至32kb)的有包膜正义单链RNA病毒。已经描述了四个属(α、β、γ和δ)，其中β冠状病毒细分为四个谱系(A、B、C和D)。在确认的冠状病毒宿主中，已尤其显示指定的禽类和哺乳动物(包括人类)被年度传播的毒株或能够引起大流行性爆发的毒株感染。人冠状病毒包括年度毒株HCoV
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OC43、HCoV
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229E、HCoV
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HKU1、HCoV
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NL63，以及大流行毒株，如2003年分离的SARS
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CoV(严重急性呼吸综合征冠状病毒)或2012年分离并仍在传播的MERS
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CoV(中东呼吸综合征冠状病毒)。SARS
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CoV和MERS
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CoV分别属于β冠状病毒谱系B和谱系C。这些冠状病毒经空气传播，并且已显示在人与人之间传播。
[0003]除了这些已知的毒株之外，2019年鉴定出了一种新的冠状病毒株，命名为2019
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nCoV(或新近命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2))，它当前感染人类，导致大量受感染的人宿主严重疾患或死亡。这种高致病性毒株从动物传染源出现在人类群体中，并且已经证明是造成高病死率(包括人与人之间的传播)的原因，这引起了对冠状病毒大流行的高度关注。2020年1月30日，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布爆发了国际关注的突发公共卫生事件(Public Health Emergency of International Concern)，接着，在2020年3月11日称作大流行病。WHO还宣布了这种新冠状病毒疾病的名称：COVID
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19。
[0004]到目前为止，全世界几乎有1亿人受到SARS
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CoV
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2大流行的影响，超过200万人死于COVID
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19。这种大流行病造成了前所未有的全球社会和经济破坏，预计全世界“乐观损失”为3.3万亿美元，最坏情况损失为82万亿美元(The GDP Risk；2020)。虽然病毒目前在欧洲和北半球以第二波爆发式扩散，但还没有显示出预防或治愈该疾病的特定治疗。在强制执行公共卫生措施的同时，需要有效的疫苗才能恢复到COVID
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19前的常态。因此，需要提出这样一种疫苗候选物：其用于诱导针对SARS
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CoV
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2的免疫应答，并潜在地提供针对SARS
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CoV
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2或尽可能针对更广泛冠状病毒株(例如流行株或大流行株)的保护作用。
[0005]本专利技术满足了这些和其它需要。
[0006]专利技术简述
[0007]本专利技术提供了触发针对冠状病毒的免疫应答的冠状病毒衍生的载体抗原。因此，本专利技术涉及一种活性成分(即表达一种或多种冠状病毒抗原的活减毒重组麻疹病毒)，以及其在引发免疫，特别是针对2019
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nCoV(SARS
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CoV
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2)株的保护性免疫以及针对各种冠状病毒株的有利广谱保护性免疫中的用途。本专利技术还涉及SARS
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CoV
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2的天然抗原衍生的多肽，其中该多肽具有可用于设计有效免疫原(特别是设计针对冠状病毒感染的疫苗候选物)的特性。本专利技术还涉及编码SARS
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CoV
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2的天然抗原或编码SARS
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CoV
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2的天然抗原衍生的多肽的多核苷酸，特别是适于由重组麻疹病毒表达或从生产细胞中改善的回收的多核苷酸。
[0008]本专利技术还涉及用于制备表达从SARS
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CoV
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2的抗原获得的多肽的重组麻疹病毒的
方式，以及由此获得的重组麻疹病毒。
[0009]本专利技术还涉及一种包含表达从SARS
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CoV
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2的抗原获得的多肽的重组麻疹病毒的免疫原性组合物。本专利技术还涉及这种免疫原性组合物用于在动物宿主，特别是哺乳动物宿主，尤其是人宿主中引发针对SARS
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CoV
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2且任选地针对其它冠状病毒或针对由感染引起的疾病的保护性免疫应答的用途。本专利技术还涉及一种用于治疗有此需要的宿主，特别是预防性治疗SARS
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CoV
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2感染和任选地其它冠状病毒或由感染引起的疾病的方法。
[0010]特别地，在第一方面，本专利技术提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含：编码麻疹病毒(MV)的减毒株的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子；以及编码以下的第一异源多核苷酸：(a)SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的刺突(S)蛋白，或(b)(a)中的全长S蛋白的免疫原性片段，该免疫原性片段选自SEQ ID NO:11的S1多肽、SEQ ID NO:13的S2多肽、SEQ ID NO:7的Secto多肽，以及SEQ ID NO:16的tri
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Secto多肽，或(c)(a)或(b)的变体，其中1至10个氨基酸通过插入、置换、或缺失而被修饰。在一些实施方案中，(c)中的变体编码包含以下的多肽：(i)使表达的全长S蛋白维持于其融合前构象的突变，和/或(ii)使S蛋白的弗林蛋白酶切割位点失活的突变，和/或(iii)使内质网回收信号(EERS)失活的突变，和/或(iv)使位于S蛋白的S1结构域中的受体结合结构域(RBD)维持闭合构象的突变，并且其中第一异源多核苷酸定位在位于MV的P基因与M基因之间的额外转录单元(ATU)(ATU2)中，或在位于MV的H基因下游的ATU(ATU3)中。在一些实施方案中，使表达的全长S蛋白维持于其融合前构象的突变是在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置986和987处置换为两个脯氨酸残基的突变(K986P和V987P)、或在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置817、892、899、942、986和987处置换为六个脯氨酸残基的突变(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)，和/或使S蛋白的弗林蛋白酶切割位点失活的突变是在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置682、683和685处S1/S2弗林蛋白酶切割位点中存在的三个氨基酸残基置换的突变(R682G、R683S和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸构建体，其包含：(1)编码麻疹病毒(MV)减毒株的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子；以及(2)第一异源多核苷酸，所述第一异源多核苷酸编码：(a)SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的刺突(S)蛋白，或(b)(a)中的全长S蛋白的免疫原性片段，所述免疫原性片段选自SEQ ID NO:11的S1多肽、SEQ ID NO:13的S2多肽、SEQ ID NO:7的Secto多肽，以及SEQ ID NO:16的tri
‑
Secto多肽，或(c)(a)或(b)的变体，其中1至10个氨基酸通过插入、置换或缺失而被修饰。2.根据权利要求1的核酸构建体，其中(c)中的所述变体编码包含以下的多肽：(i)使表达的全长S蛋白维持于其融合前构象的突变，和/或(ii)使S蛋白的弗林蛋白酶切割位点失活的突变，和/或(iii)使内质网回收信号(EERS)失活的突变，和/或(iv)使位于S蛋白的S1结构域中的受体结合结构域(RBD)维持闭合构象的突变，并且其中所述第一异源多核苷酸定位在位于MV的P基因与M基因之间的额外转录单元(ATU)(ATU2)中，或在位于MV的H基因下游的ATU(ATU3)中。3.根据权利要求2的核酸构建体，其中：(i)所述使表达的全长S蛋白维持于其融合前构象的突变是在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置986和987处置换为两个脯氨酸残基的突变(K986P和V987P)、或在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置817、892、899、942、986和987处置换为六个脯氨酸残基的突变(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P)，和/或(ii)所述使S蛋白的弗林蛋白酶切割位点失活的突变是在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置682、683和685处S1/S2弗林蛋白酶切割位点中存在的三个氨基酸残基置换的突变(R682G、R683S和R685G)、或涵盖介于SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的位置675处的氨基酸与位置685处的氨基酸之间的S1/S2弗林蛋白酶切割位点的环缺失的突变，所述环由SEQ ID NO:50的氨基酸序列QTQTNSPRRAR组成，和/或(iii)所述使EERS失活的突变是在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置1269和1271处置换为两个丙氨酸残基的突变，和/或(iv)所述使位于S蛋白的S1结构域中的RBD维持闭合构象的突变是在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置383和985处置换为两个半胱氨酸残基的突变(S383C和D985C)、或在SEQ ID NO:3的SARS
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CoV
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2的S蛋白的氨基酸序列的位置413和987处置换为两个半胱氨酸残基的突变(G413C和P987C)；和/或(v)(c)中的所述变体编码包含选自以下的突变的多肽：在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置69和70处的氨基酸残基缺失、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置144和145处的氨基酸残基缺失、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置501处置换为酪氨酸残基的突变(N501Y)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置570处置换为天冬氨酸残基的突变(A570D)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置681处置换为组氨酸残基的突变(P681H)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置716处置换为异亮氨酸残基的突变(T716I)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置982处置换为丙氨酸残基的突变(S982A)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的
位置1118处置换为组氨酸残基的突变(D1118H)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置484处置换为赖氨酸残基的突变(E484K)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置417处置换为天冬酰胺残基的突变(K417N)、在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置417处置换为苏氨酸残基的突变(K417T)以及在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置614处置换为甘氨酸残基的突变(D614G)。4.根据权利要求1至3中任一项的核酸构建体，其进一步包含编码至少一种选自以下的SARS
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CoV
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2的多肽的第二异源多核苷酸：核衣壳(N)多肽或与N多肽具有至少90％相同性的其变体、基质(M)多肽或与M多肽具有至少90％相同性的其变体、E多肽或与E多肽具有至少90％相同性的其变体、8a多肽或与8a多肽具有至少90％相同性的其变体、7a多肽或与7a多肽具有至少90％相同性的其变体、3A多肽或与3a多肽具有至少90％相同性的其变体，以及它们的免疫原性片段；所述第二异源多核苷酸定位在与所述第一异源多核苷酸的额外转录单元(ATU)不同的位置处的ATU内。5.根据权利要求1至4中任一项的核酸构建体，其中所述第一异源多核苷酸编码具有选自SEQ ID NO:5、7、9、15、17、19、43、45、47、49、52、54、56、58、60、62和65的氨基酸序列的多肽。6.根据权利要求4的核酸构建体，其中所述第二异源多核苷酸编码SEQ ID NO:22的N多肽、序列SEQ ID NO:24的M多肽或其胞内结构域、序列SEQ ID NO:23的E多肽、SEQ ID NO:25的ORF8多肽、SEQ ID NO:27的ORF7a多肽，以及SEQ ID NO:26的ORF3a多肽中的至少一种。7.根据权利要求1至6中任一项的核酸构建体，其中所述第一异源多核苷酸具有选自以下的开放阅读框：i.SEQ ID NO:1或2或36，其编码S多肽，ii.SEQ ID NO:10，其编码S1多肽，iii.SEQ ID NO:12，其编码S2多肽，iv.SEQ ID NO:4，其编码stab
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S多肽(S2P)，v.SEQ ID NO:6，其编码Secto多肽，vi.SEQ ID NO:8，其编码stab
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Secto多肽，vii.SEQ ID NO:14，其编码stab
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S2多肽，viii.SEQ ID NO:16，其编码tri
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Secto多肽，ix.SEQ ID NO:18，其编码tristab
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Secto多肽，x.SEQ ID NO:42，其编码S3F多肽，xi.SEQ ID NO:44，其编码S2P3F多肽，xii.SEQ ID NO:46，其编码S2PΔF多肽，xiii.SEQ ID NO:48，其编码S2PΔF2A多肽，xiv.SEQ ID NO:51，其编码T4
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S2P3F多肽(tristab
‑
Secto
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3F)，xv.SEQ ID NO:53，其编码S6P多肽，xvi.SEQ ID NO:55，其编码S6P3F多肽，xvii.SEQ ID NO:57，其编码S6PΔF多肽，xviii.SEQ ID NO:59，其编码SCCPP多肽，xix.SEQ ID NO:61，其编码SCC6P多肽，
xx.SEQ ID NO:63，其编码S
MVopt
2P多肽，xxi.SEQ ID NO:64，其编码S
MVopt
ΔF多肽，以及xxii.SEQ ID NO:66，其编码S
MVopt
2PΔF多肽。8.根据权利要求1至7中任一项的核酸构建体，其是cDNA构建体，从5
’
至3
’
端包含以下编码开放阅读框的多核苷酸：(a)编码MV的N蛋白的多核苷酸；(b)编码MV的P蛋白的多核苷酸；(c)如权利要求1
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3、4和6中任一项所定义的第一异源多核苷酸；(d)编码MV的M蛋白的多核苷酸；(e)编码MV的F蛋白的多核苷酸；(f)编码MV的H蛋白的多核苷酸；(g)编码MV的L蛋白的多核苷酸；并且其中所述多核苷酸在所述核酸构建体内可操作地连接，并且处于病毒复制和转录调控元件如MV前导序列和拖尾序列的控制下，并且由T7启动子和T7终止子框定，并且由适于在载体中克隆的限制性位点框定，以提供重组MV
‑
CoV表达盒。9.根据权利要求1至8中任一项的核酸构建体，其进一步包含：(a)在所述核酸构建体的5
’
端其后为锤头状核酶序列的GGG基序，其与编码减毒MV株，特别是Schwarz株或Moraten株的全长反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的第一核苷酸相邻，以及(b)核酶的核苷酸序列，特别是丁型肝炎病毒核酶(δ)的序列，处于重组MV
‑
CoV核酸分子的3
’
端，与编码所述全长反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的最后一个核苷酸相邻。10.根据权利要求4至9中任一项的核酸构建体，其中所述第二异源多核苷酸编码SARS
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CoV
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2的N多肽，并且，所述第二异源多核苷酸被克隆在ATU中，所述ATU在与用于克隆所述第一异源多核苷酸的ATU不同的位置。11.根据权利要求1至10中任一项的核酸构建体，其中：(i)所述第一异源多核苷酸包含选自SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66的序列，并且定位在ATU2内，或(ii)所述第一异源多核苷酸包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61的序列，并且定位在ATU3内。12.根据权利要求4至10中任一项的核酸构建体，其中：(i)所述第一异源多核苷酸定位在ATU3内，并且所述第二异源多核苷酸定位在ATU2内，或(ii)所述第一异源多核苷酸定位在ATU2内，并且所述第二异源多核苷酸定位在ATU3内。13.根据权利要求1至12中任一项的核酸构建体，其中所述麻疹病毒是选自以下的减毒病毒株：Schwarz株、Zagreb株、AIK
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C株、Moraten株、Philips株、Beckenham4A株、Beckenham 16株、CAM
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70株、TD 97株、Leningrad
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16株、Shanghai 191株和Belgrade株。14.一种用于拯救重组麻疹病毒(MV)的转移载体，其包含根据权利要求1至13中任一项
的核酸构建体。15.一种转移载体，其包含编码SARS
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CoV
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2的多肽的序列，所述序列选自：i.SEQ ID NO:1或2或36(构建体S)，ii.SEQ ID NO:4(构建体stab
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S)，iii.SEQ ID NO:6(构建体Secto)，iv.SED ID NO:8(构建体stab
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Secto)，v.SEQ ID NO:10(构建体S1)，vi.SEQ ID NO:12(构建体S2)，vii.SEQ ID NO:14(构建体stab
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S2)，viii.SEQ ID NO:16(构建体tri
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Secto)，ix.SEQ ID NO:18(构建体tristab
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Secto)，x.SEQ ID NO:42(构建体S3F)，xi.SEQ ID NO:44(构建体S2P3F)，xii.SEQ ID NO:46(构建体S2PΔF)，xiii.SEQ ID NO:48(构建体S2PΔF2A)，xiv.SEQ ID NO:21或37(构建体N)，xv.SEQ ID NO:51(构建体T4
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S2P3F(tristab
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Secto
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3F))，xvi.SEQ ID NO:53(构建体S6P)，xvii.SEQ ID NO:55(构建体S6P3F)，xviii.SEQ ID NO:57(构建体S6PΔF)，xix.SEQ ID NO:59(构建体SCCPP)，xx.SEQ ID NO:61(构建体SCC6P)，xxi.SEQ ID NO:63(构建体S
MVopt
2P)，xxii.SEQ ID NO:64(构建体S
MVopt
ΔF)，以及xxiii.SEQ ID NO:66(构建体S
MVopt
2PΔF)。16.一种Schwarz株的重组麻疹病毒，其在基因组中包含与其可操作地连接的表达盒，所述表达盒包含根据权利要求1至13中任一项的核酸构建体。17.根据权利要求16的重组麻疹病毒，其进一步表达选自SARS
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CoV
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2毒株的N、M、E、ORF7a、ORF8和ORF3a的至少一种多肽，以及它们的免疫原性片段。18.一种免疫原性组合物或疫苗，其包含(i)有效剂量的根据权利要求16或17的重组麻疹病毒，以及(ii)药学上可接受的媒介物，其中所述组合物或所述疫苗在单次免疫后在动物宿主中引发针对SARS
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CoV
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2的多肽的中和体液应答和/或细胞应答。19.根据权利要求18的免疫原性组合物或疫苗，其用于在有此需要的宿主中引发针对SARS
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CoV
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2的保护性体液免疫应答和/或细胞免疫应答。20.一种用于拯救表达SARS
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CoV
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2的多肽的重组麻疹病毒的方法，所述SARS
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CoV
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2的多肽由SARS
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CoV
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2的如权利要求1
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3、4和6中任一项所定义的第一异源多核苷酸编码，所述方法包括：(a)用(i)根据权利要求1至13中任一项的核酸构建体或根据权利要求13或14的质粒载体，以及用(ii)编码MV L聚合酶的载体共转染稳定表达T7 RNA聚合酶和麻疹病毒N和P蛋白
的辅助细胞；(b)使经转染的细胞维持在适于产生重组麻疹病毒的条件下；(c)通过将使重组麻疹病毒能够增殖的细胞与步骤(b)的经转染的细胞共培养，对使重组麻疹病毒能够增殖的细胞进行感染；以及(d)收获所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：巴斯德研究院，
类型：发明
国别省市：