电致化学发光生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种电致化学发光生物传感器的制备方法，包括分级花状金微结构阵列的合成，以Pt电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，预处理过的ITO电极为工作电极，通过电沉积后，取出漂洗并自然风干；进行组装，取三(2

【技术实现步骤摘要】
电致化学发光生物传感器的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种电致化学发光生物传感器的制备方法，属于生物传感器


技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)由原发性实体肿瘤分离并转移至外周血中，与癌症转移和复发密切相关。检测和分析CTCs既为个体化治疗和癌症早期诊断提供重要的临床信息，又能实现对肿瘤动态的实时监测和治疗效果的评估。然而早期癌症患者血液中的CTCs数量极少且丰度极低，使其作为肿瘤标志物的检测相当困难。
[0003]随着纳米科技的迅速发展，研究发现细胞表面微绒毛倾向于粘附和生长在具有纳米仿生结构特征的材料上。究其原因，一方面细胞丝状伪足能够感知纳米结构的存在并与之附着，以增强两者之间的作用力；另一方面，纳米结构为亲和分子功能化提供了大量活性位点，诱导更多丝状伪足的生成，从而降低细胞的迁移速度。电致化学发光(ECL)技术结合了电化学和化学发光的灵敏度高、可控性强、背景噪声低、线性范围宽和设备简单等优势，在细胞传感分析领域受到关注，然而细胞捕获效率对ECL检测准确度的影响易被忽略。
[0004]有鉴于此，确有必要提出一种电致化学发光生物传感器的制备方法，以解决上述问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种电致化学发光生物传感器的制备方法，基于适配体特异性识别靶细胞，实现了乳腺癌细胞MCF
‑
7(CTCs的一种)的高灵敏度、高特异性检测。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种电致化学发光生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：
[0007]步骤1、分级花状金微结构阵列的合成，以Pt电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，预处理过的ITO电极为工作电极，用电化学工作站在HAuCl4溶液中，通过电沉积后，取出漂洗并自然风干；
[0008]步骤2、进行组装，取三(2
‑
羧乙基)膦处理过的适配体溶液滴加到沉积有分级花状金微结构的电极表面，在恒温下孵育，用于特异性捕获细胞；
[0009]步骤3、将步骤2中孵育完的电极在1％的牛血清白蛋白溶液中浸泡，以封闭非特异性活性位点；
[0010]步骤4、取不同浓度的细胞待测液滴加到所有电极表面，在恒温下培养一段时间，然后在4％的多聚甲醛固定液中浸泡。
[0011]作为本专利技术的进一步改进，步骤1中，所述HAuCl4溶液浓度为24mM，体积为4～6mL，电流密度参数设置为
‑
0.3～
‑
0.4mA，电沉积时间为4～10min。
[0012]作为本专利技术的进一步改进，步骤1中，所述ITO电极的预处理步骤包括：依次使用洗涤剂、丙酮、乙醇及水超声清洗干净，在80℃条件下干燥30min后，将带有孔径为5mm的绝缘
胶带贴在ITO电极导电面上，控制电沉积过程的反应面积。
[0013]作为本专利技术的进一步改进，步骤2中，所述三(2
‑
羧乙基)膦与所述适配体溶液的物质的量浓度比为10:1，所述适配体溶液浓度为5～10μM，体积为20～50μL，孵育时间为6～12h。
[0014]作为本专利技术的进一步改进，步骤3中，所述细胞待测液的浓度为102～106个/mL，体积为20～50μL，细胞培养时间为45～60min。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，还包括：以ITO为工作电极，Pt丝为辅助电极，饱和甘汞为参比电极，在PBS缓冲液中进行ECL检测。
[0016]作为本专利技术的进一步改进，所述PBS缓冲液包括Ru(bpy)
32+
和三正丙胺。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，所述Ru(bpy)
32+
的浓度为100μM，所述三正丙胺的浓度为10mM，所述PBS缓冲液为0.1M KCl、Na2HPO4、NaH2PO4制成且pH＝7.4。
[0018]作为本专利技术的进一步改进，所述ECL检测采用循环伏安法，设置扫描电压为0～1.2V，光电倍增管高压为
‑
500V。
[0019]作为本专利技术的进一步改进，当步骤2、步骤3和步骤4结束后，均需要使用0.1M PBS缓冲液洗涤所有电极三次。
[0020]本专利技术的有益效果是：本专利技术制备的生物传感器具有操作简单、检测迅速的特点，并且检测时无需分离、标记以及复杂的计数过程。
附图说明
[0021]图1为本专利技术中HFGMs阵列基底的扫描电子显微镜图像，左上角为单个HFGM的放大图像。
[0022]图2为本专利技术中HFGMs阵列基底捕获细胞的丝状伪足生长情况。
[0023]图3为本专利技术中细胞传感器不同阶段的电化学阻抗图。
[0024]图4为本专利技术中细胞传感器对不同浓度的目标物的ECL信号响应结果。
[0025]图5为细胞浓度对数lgC与ECL信号的线性关系图。
具体实施方式
[0026]为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细描述。
[0027]在此，需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术，在附图中仅仅示出了与本专利技术的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本专利技术关系不大的其他细节。
[0028]另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0029]如图1至图5所示，本专利技术揭示了一种电致化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0030]步骤1、分级花状金微结构(hierarchical flower
‑
like gold microstructures，
HFGMs)阵列的合成，以Pt电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，预处理过的ITO电极为工作电极，用CHI660E电化学工作站在HAuCl4溶液中，以一定的电流密度电沉积一段时间后，取出漂洗并自然风干；
[0031]步骤2、进行组装，取三(2
‑
羧乙基)膦(TCEP)处理过的适配体M1溶液滴加到沉积有HFGMs的电极表面，在37℃下孵育一段时间，用于特异性捕获细胞；
[0032]步骤3、将步骤2中孵育完的电极在1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液中浸泡30min，以封闭非特异性活性位点；
[0033]步骤4、取不同浓度的细胞待测液滴加到上述电极表面，在37℃恒温下培养一段时间，然后在4％多聚甲醛固定液中浸泡15min。
[0034]以下将对步骤1
‑
4进行详细说明。
[0035]步骤1中，所述HAuCl4溶液浓度为24mM，体积为4～6mL，电流密度参数设置为
‑
0.3～
‑
0.4mA，电沉积时间为4～10min。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电致化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：步骤1、分级花状金微结构阵列的合成，以Pt电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，预处理过的ITO电极为工作电极，用电化学工作站在HAuCl4溶液中，通过电沉积后，取出漂洗并自然风干；步骤2、进行组装，取三(2
‑
羧乙基)膦处理过的适配体溶液滴加到沉积有分级花状金微结构的电极表面，在恒温下孵育，用于特异性捕获细胞；步骤3、将步骤2中孵育完的电极在1％的牛血清白蛋白溶液中浸泡，以封闭非特异性活性位点；步骤4、取不同浓度的细胞待测液滴加到所有电极表面，在恒温下培养一段时间，然后在4％的多聚甲醛固定液中浸泡。2.根据权利要求1所述的电致化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述HAuCl4溶液浓度为24mM，体积为4～6mL，电流密度参数设置为
‑
0.3～
‑
0.4mA，电沉积时间为4～10min。3.根据权利要求1所述的电致化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述ITO电极的预处理步骤包括：依次使用洗涤剂、丙酮、乙醇及水超声清洗干净，在80℃条件下干燥30min后，将带有孔径为5mm的绝缘胶带贴在ITO电极导电面上，控制电沉积过程的反应面积。4.根据权利要求1所述的电致化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述三(2
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：李美星，张磊，沈清明，范曲立，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：