一种鼠源性新型位点单克隆抗体阻断剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种鼠源性新型位点单克隆抗体阻断剂及其应用。本发明专利技术从具有高血清ROS含量的乙肝患者血液中筛选获得了乙肝病毒新型突变株的HBsAg抗原序列，以突变位点集中区域为目标抗原，将其核苷酸序列导入大肠杆菌表达载体中，制备并获得目标抗原；利用所述HBsAg抗原免疫动物，获得相应单克隆抗体，所述抗体能够高特异性结合目标抗原，并具有良好的热稳定性；利用所述单克隆抗体，制备相关检测试剂盒，该试剂盒具有高度的灵敏性和特异性。该试剂盒具有高度的灵敏性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠源性新型位点单克隆抗体阻断剂及其应用


[0001]本专利技术属于疾病诊断和检测领域，具体提供了一种鼠源性新型位点单克隆抗体阻断剂及其应用。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒 (hepatitis B，HBV) 感染是一个全球公共卫生问题，15
‑
25% 的慢性感染者会因肝硬化、肝细胞癌或肝炎而发展为严重疾病并过早死亡。
[0003]目前，没有针对急性乙型肝炎患者的特异性抗病毒治疗药物，大约 95% 的感染免疫功能正常的成年人会自发恢复，护理的主要目标是保持舒适、缓解症状并防止患者将感染传染给他人。对于慢性 HBV 感染者，现在已经提供一些治疗药物和治疗方案，如美国食品和药物管理局已批准治疗慢性乙型肝炎干扰素
‑
α（标准和聚乙二醇化）和口服抗病毒药物（恩替卡韦、替诺福韦、富马酸二泊西、艾拉酚替诺福韦和非首选的拉米夫定、阿德福韦二吡呋酯和替比夫定）。目前对慢性乙型肝炎的治疗可以减缓或预防肝硬化的进展，降低肝癌的发病率，提高长期生存率和生活质量，但不能治愈。因此，大多数开始乙肝治疗的患者必须终生服药，治疗的副作用和所需的定期监测增加了患者管理的难度和复杂性。因此，乙型肝炎的防治主要依赖于早期诊断和接种疫苗。
[0004]HBV是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，它于 1965 年由 Blumberg 博士发现的，Blumberg 博士因此项重大发现而获得了 1976 年诺贝尔医学奖。HBV 病毒，最初称为 Dane 颗粒，是一种 42 纳米病毒，HBV由核衣壳核心组成，被外脂蛋白外壳（也称为包膜）包围。该病毒包含3种主要结构抗原：表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）、核心抗原（Hepatitis B core antigen ，HBcAg）和e抗原（Hepatitis B e antigen，HBeAg），其中HBsAg 表达量大，在受感染个体的血液中以球形和管状颗粒（约 22 nm）的形式存在，使得HBsAg成为乙肝检测试剂和疫苗开发中的重要靶点。
[0005]HBV除可导致肝炎和肝硬化之外，还是肝癌的最主要的诱因之一，据统计，全球约 50
‑
80% 的肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）是由 HBV 感染引起的（参见Wild CP, Montesano R. A model of interaction: aflatoxins and hepatitis viruses in liver cancer aetiology and prevention. Cancer Lett. 2009;286(1):22
–
28），在过去的几十年中，已经证实HBV感染可以通过多种机制促进疾病进展，最终导致肝细胞的恶性转化，包括HBV基因整合、突变引起的基因组不稳定性、促癌信号通路的激活等，此外表观遗传学、外泌体、自噬、代谢调控、免疫抑制等诸多新机制的作用机理也在不断探索中（参见Yu Jiang, Qiuju Han,Huajun Zhao,and Jian Zhang,The Mechanisms of HBV
‑
Induced Hepatocellular Carcinoma, J Hepatocell Carcinoma. 2021; 8: 435
–
450.）。在众多作用机制中，氧化应激在肿瘤的发生和发展中起重要作用，HBV感染患者肝脏和血液中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平升高，这与疾病的严重程度和HBV的复制状态有关，并且这种活性氧的升高还通常与HBV的基因突变相关，但是目前临床上却缺乏对于相关基因突变的有效检测途径，不利于临床诊断和肝脏疾病的治疗。
[0006]本专利技术中乙肝患者血液样品中分离鉴定出导致ROS水平显著升高的新型乙肝病毒突变株，进而获得了其HBsAg氨基酸序列，并以该HBsAg为基础设计目标抗原，免疫实验动物，筛选并获得单克隆抗体，该抗体能够高特异性结合目标抗原，具有高灵敏性和特异性，为开发新型乙肝病毒检测试剂提供了新的解决方案。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术中提供了一种鼠源单克隆抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的LCDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2的LCDR2，氨基酸序列为SEQ ID NO:3的LCDR3；重链链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:4的HCDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:5的HCDR2，氨基酸序列为SEQ ID NO:6的HCDR3。
[0008]本专利技术所提供的单克隆抗体能够高度特异性结合目标抗原，所述抗原来自新型乙肝病毒突变株，所述突变株能够导致血清中ROS水平升高，使得患肝癌风险增加，为了研发相关检测试剂，实现肝癌的早诊断、早介入和早治疗提供了解决方案。
[0009]进一步的，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0010]进一步的，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0011]提供了 一种乙肝病毒表面抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0012]该乙肝病毒表面抗原为专利技术人从乙肝患者血液样品中分离鉴定而得，其在相应位点具有氨基酸突变，所述突变与患者血清中的高水平ROS密切相关；根据序列分析，选择具有较多突变位点的区域为目标抗原，采用大肠杆菌表达载体大规模制备所述HBsAg蛋白作为目标抗原，用于筛选新型单克隆抗体。
[0013]提供了一种乙肝病毒检测试剂盒，包括本专利技术中所述的鼠源单克隆抗体。
[0014]进一步的，所述的试剂盒还包括标准品冻干粉、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液。
[0015]进一步的，所述的试剂盒包括包被有所述单克隆抗体的96孔板中；辣根过氧化酶标记抗人IgG单克隆抗体作为酶标结合物；所述的标准品冻干粉为乙肝病毒表面抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述的样品稀释液为0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液；所述的洗涤液的溶剂为含有体积百分浓度为0.2%的吐温
‑
20的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液；所述的终止液为2M的硫酸水溶液；所述的显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述的辣根过氧化物酶催化底物A液是体积浓度为3%的H2O2水溶液；所述的辣根过氧化物酶催化底物B液为含0.1mg/mL的3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺的0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液。
[0016]提供了一种所述的鼠源单克隆抗体或所述的乙肝病毒表面抗原在制备乙肝病毒检测试剂中的应用。
有益效果
[0017]本申请提供了一种鼠源性新型位点单克隆抗体阻断剂及其应用，及其在制备乙肝检测试剂中的应用，具有以下优势：（1）筛选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼠源单克隆抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的LCDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2的LCDR2，氨基酸序列为SEQ ID NO:3的LCDR3；重链链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO:4的HCDR1，氨基酸序列为SEQ ID NO:5的HCDR2，氨基酸序列为SEQ ID NO:6的HCDR3。2.如权利要求1所述的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。3.如权利要求1所述的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。4.一种乙肝病毒检测试剂盒，包括权利要求1
‑
3中任一项所述的鼠源单克隆抗体。5.如权利要求4所述的乙肝病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括标准品冻干粉、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液。6.如权利要求5所述的乙肝病...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳静，詹先发，
申请(专利权)人：北京科跃中楷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：