RNA核酸适配体传感器制造技术

本发明专利技术涉及一种用于优化细胞中感兴趣的RNA序列的产生的方法，包括以下步骤：a)将能够表达感兴趣的异源RNA的载体引入多个细胞，其中所述的RNA用RNA标签标记，所述的RNA标签包含能够稳定荧光团的核酸适配体和能够稳定核酸适配体的支架；b)在允许感兴趣的异源RNA表达的条件下，在培养基中培养细胞；c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；以及d)鉴定那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的RNA的高表达的细胞。高表达的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA核酸适配体传感器


[0001]本专利技术涉及用于优化异源RNA在细胞中表达的方法。同样，本专利技术涉及能够定量表达RNA的细胞。

技术介绍

[0002]近年来的研究使人们意识到，RNA不仅仅是一种过渡分子，它还具有多种调节和酶促功能。例如，已经描述了许多小RNA在基因表达的调节中起关键作用，并且RNA序列中的高阶结构，如核糖开关或核酶，充当mRNA表达的调节因子(Breaker，R.R.Natural and engined nucleaned acids as tools to explored biology.Nature 2004:432838
‑
845.Nellen，W.,and C.Hammann.Small RNAs:analysis and regulatory functions.Nucleic acids and molecular biology.Springer
‑
Verlag2005,Heidelberg,Germany)。基于其作为过渡分子(mRNA)、人工小干扰RNA分子(siRNAs)、催化活性RNA分子(核酶)、调节或相互作用RNA分子(RNA核酸适配体)的功能，RNA在治疗、生物农药和其他应用中具有作为活性成分的多用途潜力(Khan，A.U.Ribozyme:a clinic tool.Clin.Chim.Acta 2006:367,20
‑
27.Fletcher,S.J.,Reeves,P.T.,Hoang,B.T.&Mitter,N.A基于RNAi的生物农药展望.Front.Plant Sci.11,(2020).Cagliari,D.et al.非转化RNAi对害虫和植物病害的管理.Frontiers in Plant Science vol.10(2019).Zotti,M.et al.RNA干扰技术在作物防治节肢动物害虫、病原体和线虫中的应用.Pest Management Science vol.74 1239
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1250(2018).Vallazza,B.et al.重组信使RNA技术及其在癌症免疫治疗、转录替代治疗、多能干细胞诱导等方面的应用.Wiley Interdisciplinary Reviews:RNAvol.6 471
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ó
,K.&T
ü
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780(2014).Pardi,N.,Hogan,M.J.&Weissman,D.信使核糖核酸疫苗技术的最新进展.Current Opinion in Immunology vol.65 14
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20(2020).)。为了进行进一步阐明这些功能所需的测定，并为了提供用于应用的基于RNA的活性成分，需要能够产生大量给定RNA的技术。
[0003]产生RNA最直接的方法之一是体外转录RNA。这种方法是基于对所有生命形式中控制RNA合成的酶过程的模仿。用于此目的的一个常见系统是T7 RNA聚合酶，它从DNA模板开始，可以在几个小时的反应时间内产生高达毫克量的RNA。然而，并不是所有的DNA序列都同样适合通过T7聚合酶进行转录。此外，在3'末端非特异性添加核苷酸的问题导致了不均匀性，这在检查调节功能时可能是至关重要的。此外，这种方法也是劳动密集型的。此外，体外转录反应的可扩展性以及给定RNA的最大可实现量是有限的，这使得在合理的时间内大量提供给定RNA具有挑战性且成本高昂。
[0004]化学合成目前通常用于生产小于10个核苷酸和最多80个核苷酸的RNA寡核苷酸。合成是在固体载体如聚苯乙烯或可控孔玻璃上进行的，并涉及在3
’
至5
’
方向上添加相应的核苷酸。由于反应条件可以优化，化学合成可以产生任何给定的RNA，而不考虑其序列。然
而，该方法本身不适合生产具有超过100个核苷酸的较大RNA分子，并且成本也很高。
[0005]相反，大RNA分子可以通过重组表达系统有效地产生，类似于重组蛋白的工业生产。大肠杆菌已被用于这一目的，但并非没有困难：细胞内核糖核酸酶的降解、转录物的大的3
′
端和5
′
端异质性以及低RNA滴度阻碍了广泛的应用(Ponchon L，Dardel F.Recombinant RNA technology:the tRNA scaffold.Nat Methods.2007；4:571
‑
6.)。替代宿主可能提供更好的解决方案(Suzuki H，Ando T,Umekage S,Tanaka T,Kikuchi Y.Extracellular production of an RNA aptamer by ribonuclease
‑
free marine bacteria harboring engineered plasmids:a proposal for industrial RNA drug production.Appl Environ Microbiol.2010；76:786
‑
93.)。然而，到目前为止，它们尚未开发到为现有系统提供可行替代品的阶段(Baronti，L.,Karlsson,H.,M.et al.A guide to large
‑
scale RNA sample preparation.Anal Bioanal Chem.2018:410,3239
‑
3252.)。

技术实现思路

[0006]为了优化重组RNA表达系统，需要一种快速可靠的方法来鉴定对给定RNA分子表现出高表达的细胞。
[0007]该问题通过一种用于优化细胞中感兴趣的异源RNA序列的生产的方法来解决，该方法包括以下步骤：
[0008]a)将能够表达感兴趣的异源RNA的载体引入多个细胞中，其中所述的RNA用RNA标签标记，所述的RNA标签包含
[0009]‑
能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
[0010]‑
能够稳定所述的核酸适配体的支架；
[0011]b)在允许感兴趣的异源RNA表达的条件下，在培养基中培养细胞；
[0012]c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；
[0013]d)鉴定那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的RNA的高表达的细胞。
[0014]同样，该问题通过一种生产感兴趣的异源RNA的方法来解决，该方法包括以下步骤：
[0015]a)将能够表达感兴趣的异源RNA的载体引入多个细胞，其中所述的RNA用RNA标签标记，所述的RNA标签包含能够稳定荧光团的核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于优化细胞中感兴趣的异源RNA序列的产生的方法，包括以下步骤：a)将能够表达感兴趣的异源RNA的载体引入多个细胞中，其中所述的RNA用RNA标签标记，所述的RNA标签包含
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能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
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能够稳定所述的核酸适配体的支架；b)在允许感兴趣的异源RNA表达的条件下，在培养基中培养细胞；c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；d)鉴定那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的RNA的高表达的细胞。2.一种生产感兴趣的异源RNA的方法，包括以下步骤：a)将能够表达感兴趣的异源RNA的载体引入多个细胞，其中所述的RNA用RNA标签标记，所述的RNA标签包含能够稳定荧光团的核酸适配体和能够稳定所述的核酸适配体的支架；b)在允许感兴趣的异源RNA表达的条件下，在培养基中培养细胞；c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；d)鉴定和分离那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的RNA的高表达的细胞；e)从在步骤d)中分离的细胞中去除步骤a)的第一载体；f)将能够在没有RNA标签的情况下表达感兴趣的异源RNA的第二载体引入步骤e)获得的细胞中；g)通过培养在步骤f)获得的细胞来产生感兴趣的RNA。3.一种用于比较不同细胞对感兴趣的异源RNA序列的生产能力的方法，包括以下步骤：a)将能够表达感兴趣的异源RNA的载体引入多个细胞中，其中所述的RNA用RNA标签标记，所述的RNA标签包含
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能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
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能够稳定所述的核酸适配体的支架；b)在允许感兴趣的RNA表达的条件下，在培养基中培养细胞；c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；d)比较所述的多个细胞之间的荧光强度。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞是微生物细胞，特别是革兰氏阳性细菌细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)中，使用流式细...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱恩，
申请(专利权)人：森斯艾普有限公司，
类型：发明
国别省市：