一种环糊精葡萄糖基转移酶、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶、制备方法及其应用，该环糊精葡萄糖基转移酶选自氨基酸序列为SEQ ID NO:2的多肽、将氨基酸序列SEQ ID NO:2经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有环糊精葡萄糖基转移酶活性的多肽及其衍生物、氨基酸序列中包含SEQ ID NO:2且具有环糊精葡萄糖基转移酶活性的蛋白质片段中的一种或几种，该酶具备甜菊糖苷转化效率高且催化pH范围广的特点，对甜菊糖苷中的Stev和RebA的转化率分别可达到80.1%和69.3%，该方法生产周期短，成本低，转化率高，生产制得的葡萄糖基甜菊糖苷具备口感表现好，苦味、涩味、杂味弱的技术效果。技术效果。技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种环糊精葡萄糖基转移酶、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]随着生活水平的提升人们对糖类食品的摄入量在不断增加，这也导致了而高糖摄入病症的激增，高糖摄入也成为威胁人类健康的严重隐患。为了解决上述问题，有研究者专利技术了甜味剂、香精等食品添加剂，该类食品添加剂具有极高的甜度，同时甜味剂不会参与机体代谢。其中具有代表性的产品如天然甜味剂甜菊糖苷、葡萄糖基甜菊糖苷香精等产品的应用较广。甜菊糖苷在口感上存在强烈的苦味及涩味，其甜度和苦味感知与所附着的葡萄糖单位的总数相关。含有β
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葡萄糖残基较少的甜菊糖苷与含有β
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葡萄糖残基较多的甜菊糖苷相比，苦味更加明显。目前现有技术中为了获得β
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葡萄糖残基较少的甜菊糖苷常使用环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉和甜菊糖苷制备葡萄糖基甜菊糖苷。
[0003]如公开号CN105017348B，公开了一种从生物酶发酵液中提取甜菊糖苷的方法，以单糖生物酶发酵液为原料，提取高纯度甜菊糖苷RA，该提取方法包括单糖生物酶发酵液预处理和甜菊糖苷提纯。发酵液预处理包括发酵液加热、一次pH值调节、絮凝沉淀、离心分离、二次pH值调节、降温、膜过滤。甜菊糖苷提纯步骤包括大孔树脂吸附
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解析、阴阳离子交换、活性炭处理、脱溶
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浓缩、脱水干燥、一次晶体、二次晶体、脱水干燥、获得成品。该专利技术从单糖生物酶发酵液中所提取出的甜菊糖苷RA纯度高、色泽优、口感纯正，无异味。该提取方法节省能源，有利环保，降低高端甜菊糖的制造成本，同时将开辟新的原料供应渠道，实现甜菊糖苷原料质量更加稳定、数量更加充足。
[0004]再如号CN114875054A，公开了一种酶法糖基化甜菊糖苷类化合物方法及其衍生物，在糖基转移酶存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的C19连接的第一个葡萄糖基的C
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6'上和/或将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的C19连接的第一个葡萄糖基的C
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2'上。糖基化衍生物与相应底物比较，甜味增加、苦味减少，提升了口感品质，是潜在的优质甜味剂，可用作食品中的天然甜味剂、膳食补充剂及药品成分等。该方法具备产量高，效果好，方法操作简单，产品副产物极少，绿色环保无污染，生产成本低的特点，适合于工业生产。
[0005]申请人发现，现有技术中的环糊精葡萄糖基转移酶催化合成甜菊糖苷的转化率低且生产周期长，且在实际生产中多采用Novozymes公司的环糊精葡萄糖基转移酶产品，其他的环糊精葡萄糖基转移酶产品并不具备市场化的潜力，产品种类固定且口感单一，因此，急需提供一种新的环糊精葡萄糖基转移酶来解决上述问题。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术中环糊精葡萄糖基转移酶作为催化剂催化甜菊糖苷和可溶性淀粉生产葡萄糖基甜菊糖苷粗品中的问题，经过大量的试验优化后确定了最佳的生产条
件，该方法具备生产周期短，成本低，转化率高，生产制得的葡萄糖基甜菊糖苷甜度高，起甜速度快的技术效果。为了克服现有技术中葡萄糖基甜菊糖苷生产时存在的产物种类固定，产品口感单一，生产周期长的问题，本申请提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶、制备方法及其应用，本申请中的环糊精葡萄糖基转移酶，其氨基酸序列SEQ ID NO:2，本申请提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，将氨基酸序列SEQ ID NO:2进行密码子优化，再将优化后的核苷酸序列连接到载体上，导入宿主，获得可表达β
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环糊精葡萄糖基转移酶的工程菌株，再对该工程菌株进行培养制备环糊精葡萄糖基转移酶，本申请还提供了该酶在甜菊糖苷和可溶性淀粉制备葡萄糖基甜菊糖苷中的应用，该应用具备生产周期短，成本低，转化率高，生产制得的葡萄糖基甜菊糖苷甜度高，起甜速度快的技术效果。
[0007]本专利技术的具体技术方案为：一种环糊精葡萄糖基转移酶，选自氨基酸序列为SEQ ID NO:2的多肽、将氨基酸序列SEQ ID NO:2经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具β
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环糊精葡萄糖基转移酶活性的多肽及其衍生物、氨基酸序列中包含SEQ ID NO:2且具有β
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环糊精葡萄糖基转移酶活性的蛋白质片段中的一种或几种。
[0008]本申请提供了一种的新的环糊精葡萄糖基转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，该氨基酸序列来源于保藏编号为CGMCC No.23164的大岛盐碱芽孢杆菌的β
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环糊精葡萄糖基转移酶，该β
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环糊精葡萄糖基转移酶在将甜菊糖苷和可溶性淀粉转化为葡萄糖基甜菊糖苷的过程中可以起到催化作用，其具备较高的甜菊糖苷转化效率，对甜菊糖苷中的Stev转化率可达到80.1％，对甜菊糖苷中的RebA转化率可达到69.3％。
[0009]一种环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，制备方法如下：(1)根据氨基酸序列SEQ ID NO:2制备多核苷酸；(2)将步骤(1)中的多核苷酸连接载体构建异源表达质粒；(3)将步骤(2)中的异源表达质粒转化至宿主中获得异源表达菌株；(4)将步骤(3)中的异源表达菌株进行发酵，发酵完毕后收集培养物并离心，从离心获得的发酵上清液或菌体中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶。
[0010]本申请提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，该方法先根据氨基酸序列SEQ ID NO:2制备多核苷酸，再经异源表达质粒构建、异源表达菌株构建、异源表达菌株发酵、蛋白纯化等步骤制得环糊精葡萄糖基转移酶，构建的异源表达菌株所表达的环糊精葡萄糖基转移酶具备转化周期短，成本低，转化率高等特点；另外，用该酶生产制得的葡萄糖基甜菊糖苷甜度高，起甜速度快，具有很好的工业化生产价值。
[0011]作为优选，所述步骤(1)中的多核苷酸选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的任一一种。
[0012]作为优选，所述步骤(2)中的异源表达质粒选自pET
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28a(+)
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CGTase
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15或pPIC9K
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CGTase
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15中的任一一种。
[0013]作为优选，所述步骤(3)中的宿主选自酵母细胞、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、阿维链霉菌、委内瑞拉链霉菌、红霉糖多胞菌中的任一一种。
[0014]一种环糊精葡萄糖基转移酶制备葡萄糖基甜菊糖苷中的应用，采用所述的β
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环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊糖苷和可溶性淀粉制得葡萄糖基甜菊糖苷。
[0015]本申请提供了一种β
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环糊精葡萄糖基转移酶的应用，申请人将上述制得的β
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环糊精葡萄糖基转移酶作为催化剂催化甜菊糖苷和可溶性淀粉生产葡萄糖基甜菊糖苷粗品，经过大量的试验优化后确定了最本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶，其特征是，包括氨基酸序列为SEQ ID NO:2的多肽、将氨基酸序列SEQ ID NO:2经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有环糊精葡萄糖基转移酶活性的多肽及其衍生物、氨基酸序列中包含SEQ ID NO:2且具有环糊精葡萄糖基转移酶活性的蛋白质片段中的一种或几种。2.一种如权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征是，制备方法如下：（1）将氨基酸序列SEQ ID NO:2优化为多核苷酸；（2）将步骤（1）中的多核苷酸制成异源表达质粒；（3）将步骤（2）中的异源表达质粒转化至宿主中制成异源表达菌株；（4）将步骤（3）中的异源表达菌株进行发酵，发酵完毕后收集培养物并离心，从离心获得的发酵上清液或菌体中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶。3.如权利要求2所述的一种环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征是，所述步骤（1）中的多核苷酸选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中的任一一种。4.如权利要求2所述的一种环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征是，所述步骤（2）中的异源表达质粒选自pET
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28a(+)
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CGTase...

【专利技术属性】
技术研发人员：张睿钦，唐瑞琪，毕家华，刘冠辰，李言郡，沈珊珊，阮叶萍，
申请(专利权)人：杭州娃哈哈集团有限公司，
类型：发明
国别省市：