一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法技术

本发明专利技术涉及用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法，可有效解决艾叶类植物叶片的制片，用于显微观察，保证艾叶产品质量和疗效的问题。剪取新鲜的成熟艾叶类植物叶片或事先用FAA固定好的成熟艾叶类植物叶片用在清水漂洗，从叶片上剪取5

【技术实现步骤摘要】
一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法


[0001]本专利技术涉及植物显微技术，特别是一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法。

技术介绍

[0002]中药艾叶为菊科蒿属植物Artemisia argyi Levlet Vant.的干燥叶。艾叶有温经、去湿、散寒、止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗过敏等作用。艾叶晒干捣碎得“艾绒”，制艾条供艾灸用。用作“艾叶”的同属植物，除《中国药典》收载的艾Artemisia argyi Levlet Vant.作艾叶正品使用以外，还有20多种同属植物的叶在不同地区亦作“艾叶”入药，主要的几种有：蒙古蒿Artemisia mongolica(Fisch.ex Bess.) Nakai；五月艾Artemisia indica Willd.；宽叶山蒿Artemisia stolonifera (Maxim.)Komar等。这些植物的叶和艾叶一样，背面均密被灰白色蛛丝状绒毛，叶一至二回羽状深裂或半裂，叶形变化大，仅仅依靠叶形特征难以鉴定和区分（为方便起见，下面称总称艾叶类植物），这就给艾叶的准确鉴定带来了困难。艾叶类叶片质量的好坏直接影响着艾叶的药用价值和疗效。
[0003]叶表皮具有丰富的显微特征可以用于植物分类鉴定，显微特征包括：气孔特征（气孔类型、气孔密度、气孔大小）、毛被类型（腺毛、非腺毛）、腺毛和非腺毛的密度和特征（长度、宽度）、表皮细胞形态等。艾叶类植物下表面的表皮细胞、腺毛和气孔为密集的非腺毛所覆盖，使用扫描电子显微镜也难以观察。非腺毛数量观察统计需要采取一定的方法使非腺毛脱落，留下毛基，然后对上表皮和下叶表皮分离进行染色制片，从而对非腺毛的毛基进行观察和计数，此时也能够观察表皮细胞、腺毛和气孔。
[0004]艾叶类植物叶的非腺毛和腺毛脱离存在一定的困难，同时叶为纸质叶，下表皮薄，解离上表皮和下表皮时，下表皮若处理不当非常容易破碎，难以制片显微观察。长期以来也一直影响着艾叶类植物的鉴定和研究。 因此，研制一种艾叶类植物叶表皮制片方法是必需解决的技术难题。

技术实现思路

[0005]针对上述情况和艾叶类植物叶片具体特点，本专利技术之目的就是提供一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法，可有效解决艾叶类植物叶片的制片，用于显微观察，保证艾叶产品质量和疗效的问题。
[0006]本专利技术解决的技术方案是，一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法，该方法是，先后采用氢氧化钠和果胶酶解离，使非腺毛脱落，而后用试剂破坏叶肉组织，分离上表皮和下表皮，用番红染色并用水合氯醛透明后，对上表皮和下表皮分别进行观察，具体方法步骤如下：（1）叶片处理：剪取新鲜的成熟艾叶类植物叶片或事先用FAA固定好的成熟艾叶类植物叶片，在清水中将成熟叶片或固定好的叶片漂洗1
‑
3min，从叶片上剪取5
‑
7mm见方的叶片块3
‑
5块；
所述的FAA是体积比计：体积浓度70%乙醇︰冰醋酸︰甲醛=90︰5︰5的混合液；所述的艾叶类植物为蒙古蒿、五月艾、宽叶山蒿中的一种；（2）解离：在称量瓶中加入质量浓度20%氢氧化钠5
‑
10mL，放入处理过的叶片块，盖上盖子，放在水浴锅上40
‑
50℃加热1
‑
3h，然后用镊子取出叶片块，在培养皿中用清水漂洗3
‑
5min；在另一个称量瓶中加入5
‑
10mL冰醋酸，再加入果胶酶0.002g，用玻璃棒搅拌使其完全溶解，将漂洗后的叶片块放入称量瓶中，再加入浓度为1M的螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）0.5mL，盖上盖子，放在水浴锅上50
‑
55℃加热6
‑
10h，中间每间隔1h手持称量瓶轻轻旋转摇动10
‑
20s以加速解离；（3）去除非腺毛：将解离后的叶片块取出称量瓶，放置在装有蒸馏水2mL的培养皿中，用镊子按住叶片块的一端，用水浸湿的棉签轻轻擦拭叶片块的上表面和下表面，以除去非腺毛；然后取一块载玻片，取一片叶片块放在载玻片上，在叶片块位置滴一滴清水0.02mL，放在普通光学显微镜下放大100倍观察，检查非腺毛的去除情况；（4）分离上表皮和下表皮在称量瓶中加入5
‑
10mL冰醋酸，再加入2
‑
3mL双氧水、3mL无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，制成混合试剂，将去除非腺毛后的叶片块浸入混合试剂中，在20
‑
25℃下进行解离6
‑
10h，待叶片块变为白色，并产生许多小气泡，再加入双氧水5mL，在水浴锅上50
‑
55℃加热10
‑
20min，叶片块中气泡膨胀变大，用玻璃棒轻轻搅拌，使上表皮和下表皮分离；（5）染色取一块载玻片，滴1滴质量浓度0.05%的番红溶液0.02mL，用镊子将漂白后的叶表皮取出放入番红溶液中，染色5
‑
10min；（6）冲洗：叶表皮染色后，倾斜载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水，小心冲洗玻片，用于冲洗叶表皮，注意不要将叶表皮冲走；（7）透明：取一个称量瓶，加入质量浓度50%水合氯醛溶液3
‑
5mL，用胶头滴管吸取水合氯醛，将载玻片上留下的叶表皮冲进称量瓶的水合氯醛中，透明1
‑
2h；（8）显微观察：取一块载玻片，滴一滴质量浓度50%稀甘油0.02mL，用镊子将叶表皮放在甘油中，展开成片，盖上盖玻片，在普通光学显微镜下进行观察，实现对艾叶类植物叶片的显微鉴定。
[0007]本专利技术所采用的试剂为常规试剂，成本低，整个处理过程不超过24h，制片方法易操作，质量好，观察清晰，准确率高，可有效解决对艾叶类植物叶片的显微鉴定，保证艾叶类植物的质量和疗效，有显著的经济和社会效益。
附图说明
[0008]图1本专利技术五月艾上表皮光学显微镜观察（400倍）图。
[0009]图2本专利技术五月艾下表皮光学显微镜观察（400倍）图。
[0010]图3为本专利技术五月艾下表皮光学显微镜观察（1000倍）图。
[0011]图4为本专利技术宽叶山蒿上表皮光学显微镜观察（400倍）图。
[0012]图5为本专利技术宽叶山蒿下表皮光学显微镜观察（400倍）图。
[0013]图6为本专利技术宽叶山蒿下表皮光学显微镜观察（1000倍）图。
[0014]图7为本专利技术蒙古蒿上表皮光学显微镜观察（400倍）图。
[0015]图8为本专利技术蒙古蒿下表皮光学显微镜观察（400倍）图。
[0016]图9为本专利技术蒙古蒿下表皮光学显微镜观察（1000倍）图。
实施方式
[0017]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。
[0018]本专利技术在具体实施由以下实施例给出。
实施例
[0019]本专利技术一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法，具体方法步骤如下：（1）叶片处理：剪取新鲜的成熟五月艾叶片，在清水中将五本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法，其特征在于，先后采用氢氧化钠和果胶酶解离，使非腺毛脱落，而后用试剂破坏叶肉组织，分离上表皮和下表皮，用番红染色并用水合氯醛透明后，对上表皮和下表皮分别进行观察，具体方法步骤如下：（1）叶片处理：剪取新鲜的成熟艾叶类植物叶片或事先用FAA固定好的成熟艾叶类植物叶片，在清水中将成熟叶片或固定好的叶片漂洗1
‑
3min，从叶片上剪取5
‑
7mm见方的叶片块3
‑
5块；所述的FAA是体积比计：体积浓度70%乙醇︰冰醋酸︰甲醛=90︰5︰5的混合液；所述的艾叶类植物为蒙古蒿、五月艾、宽叶山蒿中的一种；（2）解离：在称量瓶中加入质量浓度20%氢氧化钠5
‑
10mL，放入处理过的叶片块，盖上盖子，放在水浴锅上40
‑
50℃加热1
‑
3h，然后用镊子取出叶片块，在培养皿中用清水漂洗3
‑
5min；在另一个称量瓶中加入5
‑
10mL冰醋酸，再加入果胶酶0.002g，用玻璃棒搅拌使其完全溶解，将漂洗后的叶片块放入称量瓶中，再加入浓度为1M的螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸0.5mL，盖上盖子，放在水浴锅上50
‑
55℃加热6
‑
10h，中间每间隔1h手持称量瓶轻轻旋转摇动10
‑
20s以加速解离；（3）去除非腺毛：将解离后的叶片块取出称量瓶，放置在装有蒸馏水2mL的培养皿中，用镊子按住叶片块的一端，用水浸湿的棉签轻轻擦拭叶片块的上表面和下表面，以除去非腺毛；然后取一块载玻片，取一片叶片块放在载玻片上，在叶片块位置滴一滴清水0.02mL，放在普通光学显微镜下放大100倍观察，检查非腺毛的去除情况；（4）分离上表皮和下表皮在称量瓶中加入5
‑
10mL冰醋酸，再加入2
‑
3mL双氧水、3mL无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，制成混合试剂，将去除非腺毛后的叶片块浸入混合试剂中，在20
‑
25℃下进行解离6
‑
10h，待叶片块变为白色，并产生许多小气泡，再加入双氧水5mL，在水浴锅上50
‑
55℃加热10
‑
20min，叶片块中气泡膨胀变大，用玻璃棒轻轻搅拌，使上表皮和下表皮分离；（5）染色取一块载玻片，滴1滴质量浓度0.05%的番红溶液0.02mL，用镊子将漂白后的叶表皮取出放入番红溶液中，染色5
‑
10min；（6）冲洗：叶表皮染色后，倾斜载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水，小心冲洗玻片，用于冲洗叶表皮，注意不要将叶表皮冲走；（7）透明：取一个称量瓶，加入质量浓度50%水合氯醛溶液3
‑
5mL，用胶头滴管吸取水合氯醛，将载玻片上留下的叶表皮冲进称量瓶的水合氯醛中，透明1
‑
2h；（8）显微观察：取一块载玻片，滴一滴质量浓度50%稀甘油0.02mL，用镊子将叶表皮放在甘油中，展开成片，盖上盖玻片，在普通光学显微镜下进行观察，实现对艾叶类植物叶片的显微鉴定。2.根据权利要求1所述的用于艾叶类植物叶片进行显微鉴定的叶表皮制片方法，其特征在于，具体方法步骤如下：
（1）叶片处理：剪取新鲜的成熟五月艾叶片，在清水中将五月艾叶片漂洗2min，从叶片上剪取6mm见方的叶片块5块；（2）解离：在称量瓶中加入质量浓度20%氢氧化钠8mL，放入处理过的叶片块，盖上盖子，放在水浴锅上45℃加热2h，然后用镊子取出叶片块，在培养皿中用清水漂洗4min；在另一个称量瓶中加入8mL冰醋酸，再加入果胶酶0.002g，用玻璃棒搅拌使其完全溶解，将漂洗后的叶片块放入称量瓶中，再加入浓度为1M的螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸0.5mL，盖上盖子，放在水浴锅上53℃加热8h，中间每间隔1h手持称量瓶轻轻旋转摇动10
‑
20s以加速解离；（3）去除非腺毛：将解离后的叶片块取出称量瓶，放置在装有蒸馏水2mL的培养皿中，用镊子按住叶片块的一端，用水浸湿的棉签轻轻擦拭叶片块的上表面和下表面，以除去非腺毛；然后取一块载玻片，取一片叶片块放在载玻片上，在叶片块位置滴一滴清水0.02mL，放在普通光学显微镜下放大100倍观察，检查非腺毛的去除情况；（4）分离上表皮和下表皮在称量瓶中加入8mL冰醋酸，再加入3mL双氧水、3mL无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，制成混合试剂，将去除非腺毛后的叶片块浸入混合试剂中，在22℃下进行解离8h，待叶片块变为白色，并产生许多小气泡，再加入双氧水5mL，在水浴锅上53℃加热15min，叶片块中气泡膨胀变大，用玻璃棒轻轻搅拌，使上表皮和下表皮分离；（5）染色取一块载玻片，滴1滴质量浓度0.05%的番红溶液0.02mL，用镊子将漂白后的叶表皮取出放入番红溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘孟奇，王小巧，罗晓，张飞，陈随清，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：