以蔗糖为底物合成D-阿洛酮糖平衡转化率的方法技术

本发明专利技术公开了一种以蔗糖为底物合成D

【技术实现步骤摘要】
以蔗糖为底物合成D
‑
阿洛酮糖平衡转化率的方法


[0001]本专利技术属于合成生物
，具体涉及一种以蔗糖为底物合成D
‑
阿洛酮糖平衡转化率的方法。

技术介绍

[0002]D
‑
阿洛酮糖是D
‑
果糖在C
‑
3位的差向异构体，在自然界中含量稀少，甜度为蔗糖的70％，能量仅占0.3％。同时，D
‑
阿洛酮糖被美国食品药品监督管理局评为“GRAS”安全级，允许将其添加在食品、膳食补充剂以及医药制剂中。D
‑
阿洛酮糖具有许多有益人体健康的特殊功能，例如摄入适量的D
‑
阿洛酮糖可以降低血糖血脂水平、减少脂肪堆积、清除活性氧的活性等，因此受到越来越多的关注，而开发一种高效生产D
‑
阿洛酮糖的方法成为了满足市场增长的必要条件。
[0003]近年来大多数研究者用D
‑
阿洛酮糖3
‑
差向异构酶(DPEase)催化D
‑
果糖合成D
‑
阿洛酮糖。不同来源的DPEase在大肠杆菌中异源表达时，D
‑
果糖至D
‑
阿洛酮糖的平衡转化率可以达到20
‑
30％。最近也有研究者将底物D
‑
果糖替换为易得、低价的D
‑
葡萄糖，由葡萄糖异构酶与D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶共表达合成Dr/>‑
阿洛酮糖。双酶体系表达中，D
‑
葡萄糖合成D
‑
阿洛酮糖的平衡转化率在12％
‑
16％之间，但底物和中间底物积累严重。现有一种两步法是利用L
‑
鼠李树胶糖激酶，将D
‑
阿洛酮糖磷酸化为D
‑
阿洛酮糖
‑1‑
磷酸，提高催化体系平衡反应转化率，再使用去磷酸化策略将磷酸基团脱去，转变为D
‑
阿洛酮糖。该法尽管提高了转化效率，但由于它需要两步进行在实际生产中操作更加繁琐，耗费较长的时间，从而导致影响生产效率。
[0004]全细胞一步生产相对比纯酶反应，全细胞反应不需要繁琐的蛋白纯化过程，操作简单方便，并且全细胞更能适应外界环境变化，胞内的辅酶因子也能对多酶级联反应起到积极作用。利用全细胞生产D
‑
阿洛酮糖更能适应工业化生产，并且产物也相对容易分离，在操作上更加便捷从而极大降低生产成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种以蔗糖为底物联合糖酵解与ATP再生系统的全细胞合成D
‑
阿洛酮糖的方法，利用该方法可以提高D
‑
阿洛酮糖的产率。
[0006]为解决上述技术专利技术，本专利技术的技术方案是：
[0007]本专利技术所述一种以蔗糖为底物合成D
‑
阿洛酮糖的方法，以蔗糖为底物，加入重组大肠杆菌湿菌体及辅因子后进行全细胞催化反应制得；所述的重组大肠杆菌至少同时表达蔗糖磷酸化酶smsp、磷酸葡萄糖变位酶pgm、葡萄糖异构酶gi、多聚磷酸盐葡萄糖激酶ppgk、6
‑
磷酸葡萄糖异构酶pgi、D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
3差向异构酶a6pe以及D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
磷酸酯酶a6pp，并过表达腺苷激酶adk。
[0008]所述的重组大肠杆菌按以下方法进行构建：将蔗糖磷酸化酶基因smsp插入在质粒
pRSFDuet
‑
1上，得到重组质粒pRSFDuet
‑
smsp；将磷酸葡萄糖变位酶基因pgm连接在pRSFDuet
‑
smsp上，得到重组质粒pRSFDuet
‑
smsp
‑
pgm；将6
‑
磷酸葡萄糖异构酶基因pgi连接到载体pETDuet
‑
1上得到重组质粒pETDuet
‑
pgi，再将D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
3差向异构酶基因a6pe连接在pETDuet
‑
pgi上，得到重组质粒pETDuet
‑
pgi
‑
a6pe；将D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
磷酸酯酶基因a6pp连接到质粒pACYCDuet
‑
1上得到pACYCDuet
‑
a6pp，再将葡萄糖异构酶基因gi连接到质粒pACYCDuet
‑
a6pp上得到pACYCDuet
‑
a6pp
‑
gi；将多聚磷酸盐葡萄糖激酶基因ppgk连接到质粒pCDFDuet
‑
1上，得到重组质粒pCDFDue
‑
ppgk，再将腺苷激酶基因adk连接到质粒pCDFDue
‑
ppgk，得到pCDFDue
‑
ppgk
‑
adk；再将重组质粒pRSFDuet
‑
smsp
‑
pgm、重组质粒pETDuet
‑
pgi
‑
a6pe、重组质粒pACYCDuet
‑
a6pp
‑
gi和重组质粒pCDFDue
‑
ppgk
‑
adk转化至大肠杆菌BL21中，得到重组大肠杆菌。
[0009]所述的蔗糖磷酸化酶基因smsp来源于Streptococcus mutans，所述的6
‑
磷酸葡萄糖异构酶基因pgi来源于Clostridium bolteaeATCCBAA
‑
613。
[0010]所述全细胞催化反应条件是：以蔗糖为底物，底物浓度为20～100g/L；pH7～10，反应温度为30～50℃，反应时间12～18h，反应时添加辅因子；所述辅因子为金属离子和腺苷三磷酸，所述的金属离子至少为Mg
2+
、Mn
2+
、Co
2+
、Ca
2+
之一。
[0011]所述的Mg
2+
添加量为5～20mM，腺苷三磷酸的添加量为16～40mM。
[0012]所述全细胞催化反应Mg
2+
的添加量为：5mM，反应温度37℃，pH为7.5。
[0013]所述重组大肠杆菌湿菌体按以下操作进行制备：将所述重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用IPTG在20℃条件下诱导20
‑
24h,收集得到湿菌体。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以蔗糖为底物合成D
‑
阿洛酮糖的方法，其特征在于，以蔗糖为底物，加入重组大肠杆菌湿菌体及辅因子后进行全细胞催化反应制得；所述的重组大肠杆菌至少同时表达蔗糖磷酸化酶smsp、磷酸葡萄糖变位酶pgm、葡萄糖异构酶gi、多聚磷酸盐葡萄糖激酶ppgk、6
‑
磷酸葡萄糖异构酶pgi、D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
3差向异构酶a6pe以及D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
磷酸酯酶a6pp，并过表达腺苷激酶adk。2.根据权利要求1所述合成D
‑
阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌按以下方法进行构建：将蔗糖磷酸化酶基因smsp插入在质粒pRSFDuet
‑
1上，得到重组质粒pRSFDuet
‑
smsp；将磷酸葡萄糖变位酶基因pgm连接在pRSFDuet
‑
smsp上，得到重组质粒pRSFDuet
‑
smsp
‑
pgm；将6
‑
磷酸葡萄糖异构酶基因pgi连接到载体pETDuet
‑
1上得到重组质粒pETDuet
‑
pgi，再将D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
3差向异构酶基因a6pe连接在pETDuet
‑
pgi上，得到重组质粒pETDuet
‑
pgi
‑
a6pe；将D
‑
阿洛酮糖
‑6‑
磷酸
‑
磷酸酯酶基因a6pp连接到质粒pACYCDuet
‑
1上得到pACYCDuet
‑
a6pp，再将葡萄糖异构酶基因gi连接到质粒pACYCDuet
‑
a6pp上得到pACYCDuet
‑
a6pp
‑
gi；将多聚磷酸盐葡萄糖激酶基因ppgk连接到质粒pCDFDuet
‑
1上，得到重组质粒pCDFDue
‑
ppgk，再将腺苷激酶基因adk连接到质粒pCDFDue
‑
ppgk，得到pC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继栋，吕菁，王志琦，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：