一种用于蛋白靶向降解的mRNA分子及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于蛋白靶向降解的mRNA分子及应用。本发明专利技术公开的用于蛋白靶向降解的mRNA分子依次包括5'帽子结构、5'端非编码区、Kozak元件、编码区、3'端非编码区和多聚腺苷酸结构，所述编码区包括功能性多肽编码基因，所述功能性多肽包括依次连接的VHL E3泛素连接酶靶向肽、连接肽和目的蛋白靶向多肽。本发明专利技术的用于蛋白靶向降解的mRNA分子具有更高的安全性，能够完善肽PROTACs的抗肿瘤效力，解决了关键的细胞穿透问题，可以高效靶向降解目的蛋白，提供了一种新的蛋白靶向降解分子模式，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于蛋白靶向降解的mRNA分子及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域中，一种用于蛋白靶向降解的mRNA分子及应用。

技术介绍

[0002]在世界各国，癌症是导致死亡的主要原因，也是提高人类平均寿命的重要障碍。目前癌症的治疗策略多种多样，主要有化疗、手术和放疗。其中化疗自1940年代至今仍然是癌症的主要治疗方法，抗癌药物是目前药物研发的重点方向。然而，化学疗法常常伴随着一些毒副作用，这些副作用通常是由抗癌药物对骨髓中的造血细胞、毛囊、消化道和生殖系统中的细胞产生的不良影响。因此，研发抗癌药致力于改善非特异性和靶向性。
[0003]在肿瘤形成过程中，由于基因的表达水平与正常细胞相比发生明显的变化，出现蛋白表达异常的现象，比如生长因子受体的高水平表达，蛋白的过量表达与肿瘤形成具有因果关系。肿瘤细胞中过表达蛋白可作为肿瘤标记物用于早期癌症的准确诊断，同时还可以作为抗肿瘤药物攻克的靶点。乳腺癌是一个常见的癌症。其中，雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)信号通路促进乳腺癌生长的类型是最为高发的乳腺癌，约占总患者人数的70％。因此，ERα已成为乳腺癌治疗的重要靶点。几十年来，雌激素抑制剂和ERα拮抗剂已成为ER+乳腺癌的主要治疗方式。
[0004]蛋白靶向降解是肿瘤治疗中常用的策略之一。细胞内蛋白泛素化降解是维持细胞功能平衡的必要途径，将之应用到肿瘤治疗当中则产生了目前具有代表性的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)技术。PROTACs能够通过募集细胞天然的降解工具泛素
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蛋白酶体系统(UPS)降解靶标蛋白。PROTACs具有巨大的潜力，它能够降解传统小分子抑制剂无法涉及的不可成药蛋白和非酶蛋白，改善过往几十年用于化学治疗的小分子抑制剂的缺陷，即非特异性以及耐药性。相关的报道和临床验证的数据提供为该项技术的发展提供动力。随着越来越多的目光投向PROTACs，作为具有前景的技术不仅在靶标范围和分子设计上开拓，在环境响应性、肿瘤靶向性也在不断创新。该技术发展至今已有二十年，分子形式主要是化学小分子和肽模拟分子，而近年来出现以核酸分子为代表的生物分子作为配体，强调PROTACs需要重视生物相容性和安全性。
[0005]随着Moderna和Pfizer/BioNTech针对COVID
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19开发的mRNA疫苗的成功，mRNA技术得到了前所未有的关注。mRNA疫苗具有低成本制造和更安全的潜力，正是由于这些优势，Moderna在获得目标抗原的核苷酸序列后仅42天就设计并生产了应用于人体的SARS
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CoV
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2mRNA疫苗(mRNA
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1273)。更值得关注的是，Moderna和Pfizer/BioNTech生产的SARS
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CoV
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2mRNA疫苗在III期临床试验和普通人群中显示出非常高的疗效(在≤6个月的随访中约为90％)。
[0006]mRNA应用的拓展与不断完善的体外转录mRNA(IVT
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mRNA)技术息息相关，这一项合成技术提高mRNA在细胞内的稳定性和翻译效率。与亚基疫苗、灭活和减毒病毒疫苗以及DNA疫苗相比，使用IVT
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mRNA具有以下几点优势：安全性，mRNA在细胞质就立即翻译，通过细胞机制直接翻译成靶蛋白，无需进入细胞核，因此不存在感染或插入诱变的潜在风险；稳定
性，各种修饰使得mRNA更加稳定，翻译效率也更高；成本低，mRNA具有快速、便宜、可大量生产的优势。除了疫苗这一用途，mRNA还应用于蛋白质替代疗法当中，但它的潜力远不止于此。因此，随着体外转录mRNA技术的迅速完善，未来对于新的基于mRNA的疗法的开发将至关重要。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于PROTACs降解目的蛋白的mRNA体系。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种用于蛋白靶向降解的mRNA分子，所述mRNA分子依次包括5'帽子结构(5'
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cap)、5'端非编码区、Kozak元件、编码区、3'端非编码区和多聚腺苷酸结构(poly
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A)，所述编码区包括功能性多肽编码基因，所述功能性多肽包括依次连接的VHL E3泛素连接酶靶向肽、连接肽和目的蛋白靶向多肽。
[0009]本专利技术的核心在于提供了一种新的体系，即基于PROTACs的mRNA体系，具体是指上述mRNA分子的各模块设置，其中5'
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cap、Kozak元件和poly
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A都是真核细胞mRNA的常规组成，Kozak元件的序列为SEQ ID No.7的第51位
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第56位所示，5'端非编码区和3'端非编码区可以为本领域的各种常规序列，本专利技术中采用β
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珠蛋白的5'端非编码区(序列为SEQ IDNo.7的第1位
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第50位所示)和α
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珠蛋白的3'端非编码区(序列为SEQ ID No.7的第897位
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第1007位所示)。编码区是用于降解目的蛋白的元件，基于PROTACs的原理，其包括VHL E3泛素连接酶靶向肽、连接肽和目的蛋白靶向多肽，其中，VHL E3泛素连接酶靶向肽序列为公知序列，如SEQ ID No.1所示，连接肽可以选择常规序列，例如SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示序列，所述目的蛋白靶向多肽为特异性靶向目的蛋白的多肽，根据目的蛋白选择或设计，根据PROTACs的原理，其具体序列不影响体系的作用。
[0010]根据本专利技术一种实施方式，所述目的蛋白为雌激素受体α，对应的目的蛋白靶向多肽的序列为SEQ ID No.4所示。相应地，所述功能性多肽的序列为SEQ ID No.6所示。
[0011]根据本专利技术另一种实施方式，所述目的蛋白为抗凋亡蛋白BCL
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x
L
，对应的目的蛋白靶向多肽的序列为SEQ ID No.5所示。相应地，所述功能性多肽的序列为SEQ ID No.11所示。
[0012]本专利技术中，为验证体系可行性，设计了报告蛋白，位于编码区，且与所述功能性多肽之间设置了用于间隔的序列，避免蛋白表达相互影响。只要设置合适间隔，编码区可以含有其他蛋白的编码基因，例如，另一种功能蛋白编码基因或报告蛋白编码基因，所述编码区可以由所述功能性多肽编码基因、另一种功能蛋白编码基因或报告蛋白编码基因，以及设置在它们与所述功能性多肽之间的间隔区组成。
[0013]根据本专利技术一种具体实施方式，所述报告蛋白为EGFP(序列为SEQ ID No.7的第57位
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第773位所示)，所述间隔区为P2A肽编码基因(序列为SEQ ID No.7的第774位
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第839位所示)。
[0014]基于上述设计原则，当所述目的蛋白为雌激素受体α时，所述mRNA分子的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白靶向降解的mRNA分子，所述mRNA分子依次包括5'帽子结构、5'端非编码区、Kozak元件、编码区、3'端非编码区和多聚腺苷酸结构，所述编码区包括功能性多肽编码基因，所述功能性多肽包括依次连接的VHL E3泛素连接酶靶向肽、连接肽和目的蛋白靶向多肽。2.根据权利要求1所述的用于蛋白靶向降解的mRNA分子，其中，所述VHL E3泛素连接酶靶向肽的序列为SEQ ID No.1所示；所述连接肽的序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示；所述目的蛋白靶向多肽为特异性靶向目的蛋白的多肽，序列优选为SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5所示；优选地，所述功能性多肽的序列为SEQ ID No.6或SEQ ID No.11所示。3.根据权利要求1所述的用于蛋白靶向降解的mRNA分子，其中，所述5'端非编码区为β
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珠蛋白的5'端非编码区，所述3'端非编码区为α
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珠蛋白的3'端非编码区。4.根据权利要求1所述的用于蛋白靶向降解的mRNA分子，其中，所述编码区还包括另一种功能蛋白编码基因或报告蛋白编码基因，以及设置在它们与所述功能性多肽之间的间隔区；优选地，所述报告蛋白为EGFP，所述间隔区为P2A肽编码基因。5.根据权利要求1所述的用于蛋白靶向降解的mRNA分子，其中，所述mRNA分子的序列为SEQ ID No.7或SEQ ID No.12所示。6.一种编码权利要求1
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5中任意一项所述的mRNA分子的DNA分子，优选地，所述DNA分子的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭英，蒋宇扬，薛晓琪，谭春燕，许乃寒，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：